香蕉枯萎病菌4号小种拮抗细菌的初步筛选及鉴定_基因-论文网

论文摘要：从香蕉根际土中分离得到87株细菌菌株，采用平板对峙法，筛选出7株对香蕉枯萎病菌4号生理小种具有拮抗作用的菌株，并进行了抑制枯萎病菌4号小种菌丝生长和孢子萌发的试验。结果显示，拮抗菌株255、D5、F2、ZK11、214、215、252的发酵液对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝具有显著抑制效果，在平板上产生的抑菌圈直径达到17.90 ~22.88 mm，并能使病菌菌丝产生畸形或泡囊状；对孢子萌发的抑制率达到64.40%~ 80.50%。通过对3株抑菌作用不同的拮抗菌株的16S rDNA鉴定和生理生化特性鉴定，结果显示，拮抗菌株255、D5和F2分别被初步鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。
论文关键词：香蕉枯萎病菌,号小种,拮抗细菌,基因,鉴定

关键词：香蕉枯萎病菌；拮抗菌；16SrRNA基因；鉴定

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusariumoxysporumfsp.cubense）侵染而引起香蕉维管束坏死的一种真菌病害。目前在香蕉枯萎病的防治方面，缺乏有效的化学防治试剂，农业防治措施也不能达到较理想的效果。因此，生物防治作为一种经济、安全、有效的防治措施成为了研究的热点。目前，对于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中于香蕉枯萎病拮抗菌的筛选及其室内盆栽防治试验。Thangavelu等报道获得对香蕉枯萎病的防治效果为48%~51%的哈兹木霉(Trichodermaharzianum)，获得防治效果为41%荧光假单孢杆菌（Pseudomonasfluorescens）能诱导植物产生系统抗性抑制香蕉枯萎病，枯草芽孢杆菌也有较好的防效。曹理想等报道，在研究香蕉内生菌区系时，发现几株玫瑰浅灰链霉菌(Streptomycesroseogriseolus)对香蕉枯萎病菌有一定拮抗作用。本试验旨

资助项目：广东省农业厅(粤农函2006-229)

*通讯作者.Authorforcorrespondence,E-mail:chunpingyou@sina.com

在从香蕉根际土壤中筛选出对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生物防治细菌菌株，并对其拮抗作用和分类地位进行研究，为香蕉枯萎病生物制剂的开发打下基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株香蕉枯萎病菌4号小种(Fusariumoxysporumf.sp.Cubenserace4)由仲恺农业工程学院植物病理实验室提供。

1.1.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA、营养琼脂培养基NA、营养肉汤培养基NB配方参考方中达的方法。

1.2方法

1.2.1土壤细菌的分离从不同果园的香蕉植株根际取得土壤样本，将1g根际土置于灭菌的小三角瓶内，加入9ml无菌水稀释，摇匀成悬浮液，用接菌环蘸取一环于NA培养基上划线分离。28℃下培养2d，在培养基上挑取不同形态的单菌落，进一步分离纯化后，挑取不同形态的单菌落进行保存。

1.2.2拮抗细菌的初步筛选保存的细菌单菌落分别接入装有20mlNB培养液的小三角瓶中，于28℃振荡培养24h。拮抗菌的筛选采用对峙培养法，先将香蕉枯萎病菌菌丝块接于平板的一侧，再在平板另一侧（与病菌菌丝块相距3cm）放上浸透细菌菌液的灭菌滤纸片，于28℃培养4d后，观察细菌对枯萎病菌的抑制效果，初步筛选出对香蕉枯萎病菌有抑制效果的拮抗细菌。

1.2.3拮抗细菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用拮抗细菌与香蕉枯萎病菌采用对峙培养的方法，在PDA平板一侧接入于PDA培养基上25℃下培养5d的香蕉枯萎病菌菌丝块（Φ5mm），在相距菌丝块边缘3cm处用打孔器打一直径为5mm的孔，吸取细菌培养液25μl注入孔中，以注入B培养液为对照，每处理4次重复。于28℃培养5d后，观察细菌是否具有拮抗效果，并测量其抑菌圈直径。

1.2.4拮抗细菌对香蕉枯萎病菌菌丝的作用方式拮抗细菌与香蕉枯萎病菌作平板对峙实验后，如果拮抗菌对枯萎病菌产生抑制效果，在抑菌圈的交界处切取菌丝块，在显微镜下进行观察，研究拮抗细菌对香蕉枯萎病菌的作用方式。以病菌菌落边缘的正常菌丝做为对照。

1.2.5拮抗细菌发酵液对香蕉枯萎病菌分生孢子萌发的抑制作用实验方法参考肖爱萍等方法，12h后观察孢子萌发率，根据下列公式计算孢子萌发抑制率：

1.2.6拮抗细菌的16SrDNA序列测定

1.2.2.1CTAB法提取细菌总基因组DNA，方法参考奥斯伯的方法

1.2.2.216SrDNA的扩增及测序：根据细菌16SrDNA的保守区，设计PCR引物。上、下游引物序列分别为PrimerF：5'-CGGCTACCTTGTTACGAC和PrimerR：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应体系（50μL）：TaqTMDNA聚合酶(2U/μL)1μl，10×PCR缓冲液（含Mg）5.0μl，dNTPMasterMix(200μmol/L)1μl，PrimerF(上游引物5pmol/L)1μl，PrimerR(下游引物5pmol/L)1μl，DNA模板2μl，ddHO补足50μl。

PCR反应条件：95℃预变性7min：94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸90s，循环30次；72℃终延10min，4℃保存。

取4μlPCR产物用1%琼脂糖电泳（90V/50min）检测，紫外灯下观察DNA条带。目标片段由上海生物技术工程有限公司测序。测序结果登陆GenBank，进行BLAST比对。

1.2.7拮抗细菌形态与生理生化特征测定：革兰氏染色、芽孢染色、糖类的利用、吲哚的产生、需氧性等测定参考东秀珠等的方法。

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