论文摘要：本实验以中国野生华东葡萄株系白河-35-1为材料，从白粉病病原菌诱导的cDNA 文库中筛选到一条与胁迫相关的EST序列。利用RACE技术获得基因全长为836 bp，编码一个175个氨基酸的广谱抗性相关蛋白（VpUSP）（登录号：GU946975）。利用半定量RT-PCR技术，研究了VpUSP在中国野生华东葡萄抗病、感病株系中RNA水平上的表达方式，结果表明华东葡萄感病株系在接种白粉病前后均有表达，且表达量变化不明显；抗病华东葡萄株系在接种白粉病后VpUSP基因表达量呈增加趋势，48h时达到表达高峰而后降低，这表明VpUSP基因参与了中国野生华东葡萄的抗白粉病过程。
论文关键词：中国野生葡萄,基因克隆,白粉病
葡萄白粉病（UncinulanecatorSchw.Burr）是严重危害世界的一种真菌性病害。在葡萄著名产区如美国加州，法国，意大利，澳大利亚，中国新疆等地区，葡萄白粉病比较严重，给葡萄生产造成很大的经济损失。利用基因工程手段与传统育种技术相结合,发掘抗病葡萄种质的抗病基因,培育抗病新品种是解决此问题的有效途径之一。
USP蛋白是一种普遍存在于植物中的抗性相关蛋白，一般存在于细胞质中，在植物受到外界胁迫时表达上调，增强植物的抗逆性。USP相关蛋白在水稻中至少由10个基因编码，在拟南芥中由17个基因编码，它们都被定位在第5条染色体上。在许多双子叶植物与单子叶植物受到非生物胁迫时，克隆到USP相关基因，但在植物受到生物胁迫时的相关基因克隆方面还未见报道。
本研究从野生华东葡萄株系白河-35-1白粉病病原菌诱导的cDNA文库获得一条抗性相关EST序列，利用RACE技术获得基因全长。并利用半定量RT-PCR技术，研究在中国野生华东葡萄抗病、感病株系白粉菌诱导条件下VpUSP基因的表达变化方式，为深入研究该基因的在中国野生华东葡萄上的抗病性奠定了基础。
通讯作者：Tel:029-87082803.E-mail：wangyuejin@263.net
1材料和方法
1.1试剂和试材
感病华东葡萄株系：白河-35-2，“6-12-2”，广西-2；抗病华东葡萄株系：白河-35-1，“6-12-6”，白河-13-1；在西北农林科技大学葡萄种质资源圃进行接种实验；在接种前首先对要接种的叶片进行套袋1周，然后选取健康无病的幼叶，用无菌蒸馏水喷湿接种叶片的上叶面，取用田间自然条件下欧洲葡萄感白粉病的叶片，用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌，接种后立即套袋。在接种后0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h剪取1.0cm2大小的幼叶叶片，立即放置液氮中。
本研究中RACE试剂盒购自Clontech（美国）公司，反转录试剂盒、pGEMT-easyVector载体购自Promage（美国）公司。DL2000Marker、rTaq酶均为TaKaRa公司产品，其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2方法
1.2.1中国野生华东葡萄株系叶片总RNA的提取
采用改进的SDS∕酚法分别提取经接种白粉病菌诱导0、6、12、24、48、72、96hRNA，然后等量混合。1%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度计检测纯度和浓度。
1.2.2中国野生华东葡萄VpUSP全长基因的克隆
根据已获得的来源于华东葡萄白河-35-1白粉菌诱导的cDNA文库中的EST序列（GenBank登录号：GR884460），设计RACE特异引物。
GSP1：5'GGTGTGGGGAAAATGGAGAGTGAGCC3'
GSP2：5'CGCTTGCTGCTAATAGAGGGGTGTGGAT3'
以接种白河-35-1叶片RNA为模板，参照RACE试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA。RACE-PCR扩增参照试剂盒说明，以GSP1，GSP2为引物，进行PCR，产物回收，连接到p-GEMTeasy载体上，转化，挑取阳性克隆并测序，得到VpUSP基因5'端序列和3'端序列。利用DNAstar软件将获得的基因序列进行拼接，获得全长cDNA序列。
1.2.3中国野生华东葡萄VpUSP基因的生物信息学分析
获得的中国野生华东葡萄含VpUSP的全长基因ORF的查找和核苷酸翻译在GenBank的ORFFinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）上完成；在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上进行Blastx蛋白序列分析；用DNAstar进行进化树分析基因的相似性；蛋白质三维模型的同源建模均使用（http://www.expasy.org）网站的相关生物信息学分析软件进行。
1.2.4中国野生华东葡萄VpUSP基因诱导表达分析
以白粉菌诱导中国华东葡萄感病和抗病6株系反转录产物为模板，根据VpUSP全长基因设计引物
VpUSP1：5AGAGTGAGCCAACTCGG3
VpUSP2：5TCAGTCATCAACTGGGTC3
根据编码3-磷酸甘油醛基因设计内参引物
GAPDH1：5AACATTGTGCCAACATCCA3
GAPDH2：5ACCCCATTCATTGTCATAC3
分别以上述两组引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液(Mg2Plus)2.5μl，dNTPs（2.5mM）2μl，上游引物和下游引物各1μl,rTaq0.125μl，反转录产物1μl，超纯水补齐至25μl。PCR反应条件为：预变性94℃3min；进入如下循环：94℃30S，Tm52℃30S，72℃1min；25个循环；72℃延伸10min,4℃保存。 1/3 1 2 3 下一页 尾页 |
