论文摘要：本试验利用AFLP和SRAP标记对3组果皮色泽的变异品种（系）进行鉴别，54对AFLP引物共检测1089个位点，其中多态性条带数为688，多态性比率为63.2%；20对SRPA引物可检测210个位点，其中多态性条带为76条，多态性比率为36.2%。分析结果表明，7对AFLP引物、3对SRAP引物可区分南果与其红色变异系；3对AFLP引物、1对SRPA引物可区分考密斯、红考密斯、早红考密斯与其绿色变异系；所检测的引物均无法区分红安久及其绿色变异系。综合AFLP与SRAP标记的检测结果，获得4个品种（系）的特征谱带，SRPA引物em11/me5可区分除红安久及其变异系以外的所有供试材料，可应用于各品种（系）的分子鉴别。
论文关键词：梨,皮色,变异
前言
果皮的色泽是果实外观品质的核心指标，也是影响其商品价值的重要指标。梨属植物种质资源按
果皮颜色划分主要有绿皮、褐皮和红皮三种类型。在世界范围内的栽培种中只有西洋梨具有较多的红色品种；而中国大面积主栽的白梨、砂梨和秋子梨品种均以绿色、褐色为主，果皮色泽偏淡，在众多色泽鲜艳的果品中难以形成视觉竞争优势。为了满足市场消费的需求，培育红色果皮的梨新品种成为种质创新的一个发展热点。梨是高度杂合的多年生木本植物，易发生自然变异。目前，有关梨果皮色泽的变异品种或株系在各地均有发现，但由于传统的突变鉴定的方法主要是依据表观性状的测定和描述，难以确定其是否为饰变，即由外界环境条件改变而非遗传物质变异，此类变异易随环境条件的改变而恢复原表型，且不能遗传给后代。近年来快速发展的DNA分子标记技术可直接检测遗传物质分子水平的变化，成为目前研究者认同的鉴定变异材料的可靠依据，并成功应用于苹果、梨、石榴、甜橙以及葡萄等果树芽变系的鉴定研究中。
关于梨果皮色泽变异的鉴定，Yamamoto等曾利用9对SSR(Simplesequencerepeat)引物对‘巴梨’及其芽变‘红巴梨’进行分析，均无法区分原种及其芽变；张东等利用SSR标记技术对29个砂梨品种进行鉴定，认为红皮砂梨很可能源于绿皮砂梨的芽变。路娟等曾尝试采用SSR标记对‘红考密斯’和‘考密斯’进行鉴定，也未能获得成功。鉴于目前对梨果皮色泽变异的分子鉴定尚未有成功鉴定的相关报道，本文拟采用AFLP和SRAP标记方法对收集的几组色泽变异品种或株系进行鉴定，以期从分子水平揭示色泽变异品种（系）与原始品种的差异，从而为变异新品种的早期鉴定和保护提供更加科学、有力的技术支持，并为开展梨果皮色泽形成的分子机理奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料为3组色泽变异的品种资源或株系，品种名称及色泽性状如表1。样品分别采自南京农业大学、河北昌黎果树研究所以及辽宁省农科院果树研究所。于春季采集各材料健康植株上的幼嫩叶片，置于冰桶中，带回实验室洗净、擦干后，液氮速冻并于-20℃冰箱保存备用。
表1供试的品种（系）
Table1Cultivarsorstrainsusedinthisstudy
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编号
No.
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品种或株系
Cultivars(strains)
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外观色泽
Colour of appearance
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样品采集地
Place of sample collection
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1
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南果Nanguo
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绿色 green
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辽宁Liaoning
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2
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南果红色变异系
Red variant strain of Nanguo
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红晕 red flush
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辽宁Liaoning
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3
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考密斯 Doyenne du Comice
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绿色 green
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南京Nanjing
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4
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红考密斯
Red Doyenne du Comice
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紫红色 dark red
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南京Nanjing
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5
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早红考密斯
Early red Doyenne du Comice
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紫红色 dark red
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河北 Hebei
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6
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早红考密斯绿色变异系Green variant strain of Early red Doyenne du Comice
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绿色 green
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河北Hebei
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7
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红安久Red d’Anjou
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红色 red
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河北Hebei
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8
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红安久绿色变异系Green variant strain of Red d’Anjou
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绿色green
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河北Hebei
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1.2试验方法
1.2.1基因组DNA的提取
采用改良CTAB法提取基因组DNA，利用核酸分析仪检测DNA的浓度，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并根据实验需要进行合理稀释，于-20℃保存备用。
1.2.2AFLP标记分析
反应体系参考LuisaMonte-Corvo的研究，并结合本试验材料进行合理优化，试验采用三碱基选择性引物，引物序列参照李元军，引物合成由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成，MseI/EcoRI内切酶和T4DNA连接酶均购于纽英伦生物技术（北京）有限公司。酶切反应体系为20μL，DNA模板2μL、NEBBuffer2μL、BSA100×0.3μL、MseI0.5μL、EcoRI0.3μL、ddHO14.9μL，37℃下酶切5小时，置于65℃15min；连接反应是将EcoRIadapter1μL、MseIadapter1μL、TBuffer1μL、ddHO1.5μL混合后加入酶切产物中，连接12小时,置于65℃15min。选择性扩增的PCR产物采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色，以获得电泳图谱。
1.2.3SRAP标记分析
SRAP引物序列参照路娟的研究，PCR反应体系采用本试验室优化的体系。取4μLPCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，若与预期片段大小相近且条带清晰，再通过8.0%的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)分离，银染后观察、拍照。
1.3数据统计与处理
对于同一引物的扩增产物，有带记为“1”，无带记为“0”，弱带及分辨不清的条带忽略不计。将数据录入Excel表格，形成二元矩阵，根据Nei和Li计算相似系数，用NTSYSpc2.02软件中的SHAN程序对色泽变异品种(系)进行聚类，并作聚类图。
2结果与分析
2.1基因组DNA扩增结果
利用64对AFLP引物组合对供试品种进行PCR扩增，其中54对引物扩增出稳定、清晰的条带，扩增条带大小范围在100～500bp之间，部分引物扩增的电泳图谱如图1。对扩增条带的统计结果分析表明，54对引物在3组色泽变异品种及株系中共检测1089个位点，平均每对引物检测位点数为20，其中多态性条带数为688，多态性比率为63.2%。
采用30对SRAP引物组合对供试品种进行检测，有20对引物可扩增稳定、清晰的条带，扩增产物大小在100～1000bp范围内，部分扩增条带如图2。对扩增条带的统计分析表明，20对引物在3组色泽变异品种及株系中共检测210个位点，平均每对引物检测位点数为10.5，其中多态性条带为76条，多态性比率为36.2%。 1/3 1 2 3 下一页 尾页 |
