论文摘要：从低温诱导香蕉幼苗差异基因表达特性时分离得到的一个cDNA 差异片段入手，利用RACE和PCR技术成功克隆了一个香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因rbcS-mc的cDNA和DNA全长序列，并登录GeneBank，登陆号分别为：EF556842和FJ973633。序列分析表明该基因包含3个外显子和2个内含子，最大开放阅读框为827bp，推测编码蛋白含有293个氨基酸，分子量为32.3 kDa，等电点为8.65。将香蕉rbcS-mc基因与数据库中其它植物的rbcS基因的氨基酸序列进行序列比对，发现该基因与其他植物rbcS基因MVAPFTGLKS、ETLSYLP、YDGRYWTMWKLP及RQVQCISFI的4个结构域高度一致。系统进化分析表明香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因rbcS-mc与其它植物的1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因rbcS基因氨基酸序列具有较高的同源性，与小果野蕉亲缘关系最近。
论文关键词：香蕉,二磷酸核酮糖羧化,加氧酶小亚基基因,克隆,序列分析
光合作用是植物最重要的生理功能之一，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco）是植物光合作用过程中固定CO的关键酶，同时也参与植物的光呼吸代谢途径，消耗植物光合作用合成的有机物，对植物的光合作用效率有着异常重要的意义。高等植物的Rubisco全酶由8个大亚基（rbcL）和8个小亚基（rbcS）构成LS的异源十六聚体结构，其中由叶绿体基因编码的大亚基起催化作用，而由细胞核基因编码的小亚基具有调控RuBPCase活性的功能，全酶的组装调节最终依赖于rbcS的表达调控。因此，对于rbcS的研究具有重要的理论意义和应用价值。
迄今为止，已在多种植物中克隆了rbcS基因，并对基因的组成，结构和进化等进行了广泛的研究。但关于香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的研究很少。笔者在分析低温处理的香蕉幼苗的差异基因表达特性时，得到一个部分cDNA片段，该片段与尖叶蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基rbcS1基因同源。因此本研究在充分利用生物信息学的前提下，根据相关芭蕉属rbcS核苷酸保守序列设计引物，利用RACE和PCR技术，从香蕉中克隆了编码香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的全长cDNA和基因组DNA，旨在为进一步研究香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的功能与结构提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
供试香蕉品种为巴西香蕉（MusaAAACavendishcvbaxi.）组培袋育苗，由中国热带农业科学院组培中心提供。
试剂：大肠杆菌EscherichiacoliDH5α由本实验室保存；反转录酶M-MLV、pMD-18T购自TaKaRa公司；DNA分子量标准、凝胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒，均购自天根公司；常用内切酶、连接酶、3'-RACE及5'-RACE试剂盒为Promega和宝（大连）生物工程有限公司公司产品；焦碳酸二乙酯、RNA酶、溶菌酶等试剂为Sigma公司产品，其它为国产分析纯或分子生物学级产品。引物合成及序列测定均由上海生工生物工程公司完成。
1.2方法
1.2.1香蕉总RNA和DNA的提取及cDNA第一链的合成
取香蕉植株的第2片功能叶用于提取总RNA。用CTAB法提取总DNA。参照UNIQ-10柱式TRIZOL总RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA。以提取的香蕉幼苗总RNA为模板，Oligo（dT）为引物，由M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。
1.2.2引物的设计与合成
根据差异显示分析获得的香蕉基因cDNA片段和试剂盒要求，分别设计5′、3′RACE特异引物，引物的合成由上海生工公司完成。
表1香蕉rbcS-mc基因克隆的引物序列
Table1primersdesignedinisolatedbananarbcS-mc
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引物Primer
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核酸序列（5′→3′） Sequence （5′→3′）
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P
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GAT GAAGGC GTG
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SP1
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ACA CTG AAG GAC GAG GCG TTG CTG A
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SP2
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AGG TGG GAG AGG TCG GCG TTG GGC T
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SP3
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AGT TCT GCC CCA AAG GGT TCG TGT G
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SP4
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GTG ACA GGG AAG GCG GAG GCG GAC T
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SP5
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AGG TGG AGG AGT GCA AGA AGG AGT A
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P1
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CGACGAGTCTTCTTCTTGATCTC
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P2
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AAATCCCCTAAGGTTTAATT
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1.2.3香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基的5′RACE和3′RACE扩增
根据得到的香蕉基因cDNA片段序列，分别设计3′端RACE引物和5′RACE端引物，以总cDNA为模板，进行cDNA末端快速扩增。RACE的操作参照3′-FullRACECoreSet试剂盒和5′-FullRACECoreSet试剂盒（TaKaRa）推荐的方法进行。PCR反应条件为94℃变性3min后进入循环，循环参数为94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环。循环后72℃10min延伸。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。5′RACE和3′RACE扩增得到的目的片段分别回收、纯化后克隆至pMD18-T载体，转化感受态E.coliDH5α，应用PCR反应对阳性克隆进行鉴定，最后由上海生物工程公司对获得的阳性克隆进行DNA序列测定。
1.2.4香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基全长cDNA的克隆
根据5′RACE和3′RACE的测序结果，将3′RACE、5′RACE和已知片段进行电子拼接（VectorNTISuite10.0）获得全长cDNA序列，根据拼接序列设计全长特异性引物P1和P2，以反转录cDNA第1链为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃5min、94℃50s、55℃45s、72℃1.5min，30个循环；72℃5min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用低溶点琼脂糖凝胶电泳纯化和回收目的扩增片段。在T4DNA连接酶作用下，将回收的DNA片段插入pMD18-T载体，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，酶切鉴定重组子，DNA测序由上海生工测序部完成。
1.2.5香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组DNA的克隆
利用总DNA为模板，以特异性引物P1和P2通过PCR方法扩增rbcS-mc基因组DNA片段。 1/4 1 2 3 4 下一页 尾页 |
