论文导读:：根据从本课题组前期构建的中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下的cDNA 文库中获得的 1 条与广泛逆境蛋白相关的EST序列，设计特异引物，结合RACE技术克隆了中国野生华东葡萄白河-35-1广泛逆境蛋白基因（Universal stress protein, USP）全长序列。该基因全长836bp，编码175个氨基酸,GenBank登录号为GU946975。为了进一步研究该基因在白粉菌诱导下的表达模式，我们通过半定量RT-PCR技术，研究了VpUSP在中国野生华东葡萄抗病、感病株系中的表达变化，结果表明，广泛逆境蛋白在中国野生华东葡萄感病株系中，接种白粉病前后均有表达，但表达量变化不明显；然而，抗病的中国野生华东葡萄株系在接种白粉病后VpUSP基因表达量呈明显的增加趋势，并且在48h时达到表达高峰随后降低，初步表明中国野生华东葡萄VpUSP基因在与白粉病菌互作过程中具有表达活性。
论文关键词：中国野生葡萄，RACE，葡萄白粉病
葡萄白粉病 （Uncinula necator Schw. Burr）是严重危害世界葡萄生产的一种真菌性病害。在葡萄著名产区如美国加州，法国，意大利，澳大利亚，中国新疆等地区，葡萄白粉病为害比较严重，给葡萄生产造成巨大的经济损失。利用基因工程手段与传统育种技术相结合,发掘抗病葡萄种质的抗病基因,培育抗病新品种是解决此问题的有效途径之一。［1，2，3］
广泛逆境蛋白（Universalstress protein, USP）是一种普遍存在于植物中的抗性相关蛋白，一般存在于细胞质中，在植物受到外界胁迫时表达上调，增强植物的抗逆性［4，5，6，］。USP在水稻中至少由10个基因编码生物论文，在拟南芥中由17个基因编码，它们都被定位在第5条染色体上。在许多双子叶植物与单子叶植物受到非生物胁迫时，克隆到USP基因已有报道［7］，但在植物受到生物胁迫时的USP基因克隆方面的研究尚未见报道。
本研究从中国野生华东葡萄株系白河-35-1白粉病病原菌诱导的cDNA 文库获得一条与广泛逆境蛋白相关EST序列，结合RACE技术，获得了该基因全长序列。同时，通过半定量RT-PCR技术，研究了该基因在中国野生华东葡萄抗病、感病株系受白粉菌诱导条件下的表达变化模式，为进一步研究该基因的在中国野生华东葡萄中的抗病性作用提供依据。
1 材料和方法
1.1 试材与试剂
本研究以中国野生华东葡萄抗性株系白河-35-1，“6-12-6”，白河-13-1［3］为试材，并以中国野生华东葡萄感病株系白河-35-2，广西-2，“6-12-2”为对照。葡萄白粉菌接种采用压片法［2］。在白粉菌接种后0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h［8］采集白河-35-1葡萄叶片，在液氮中速冻后，置于-80℃冰箱备用。其他株系的反转录产物由本实验室保存。
RACE试剂盒购自Clontech（美国）公司，反转录试剂盒、pGEM T-easyVector 载体购自Promage（美国）公司。DL2000 DNA Marker、rTaq酶均为TaKaRa 公司产品，其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2方法
1.2.1中国野生华东葡萄白河-35-1接种白粉病后叶片总RNA的提取
用改进的SDS∕酚法［9］分别从中国野生华东葡萄白河-35-1叶片中提取经白粉病菌诱导0、6、12、24、48、72、96h 的总RNA。经1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取总RNA的完整性，并用Nanodrop检测样品纯度和浓度论文提纲怎么写。
1.2.2中国野生华东葡萄白河-35-1VpUSP全长基因的克隆
根据已获得的来源于华东葡萄白河-35-1 白粉菌诱导的cDNA文库中的EST核心序列（GenBank登录号：GR884460），设计RACE特异引物GSP1：5' –GGTGTGGGG
AAAATGGAGAGTGAGCC- 3'与GSP2：5' –CGCTTGCTGCTAATAGAGGGGTGTGGAT- 3'。
以接种白粉病菌的白河-35-1叶片提取的RNA混合样为模板，采用BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (BD Bio sciencesClontech)，,具体操作按说明书的方法进行RACE cDNA 扩增。扩增产物经1%的琼脂糖电泳检测，回收目标条带。
回收产物与克隆载体pGEM-TEasy于4℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，在附加Amp的平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色单克隆生物论文，接种于附加Amp的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床160rpm, 培养16-18h。经菌液PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，送公司测序。对测序获得的VpUSP基因的 5' 端序列和 3' 端序列，利用DNAstar 软件将其拼接，获得全长中国野生华东葡萄白河-35-1 VpUSP 基因cDNA全长序列。
1.2.3中国野生华东葡萄白河-35-1 VpUSP基因的生物信息学分析
中国野生华东葡萄白河-35-1VpUSP的全长基因开放阅读框（ORF）分析在NCBI的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）程序进行；推导的氨基酸序列相似性比对采用NCBI的Blastx程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；应用DNAstar对来源于不同植物的广泛逆境蛋白进化树构建。
1.2.4中国野生华东葡萄VpUSP基因诱导表达分析
根据已获得的中国野生华东葡萄白河-35-1VpUSP基因核苷酸序列，设计合成一对引物VpUSP1：5’- AGAGTGAGCCAACTCGG-3’与VpUSP2：5’-TCAGTC ATCAA CTGGGTC-3’用于RT-PCR分析。同时以3-磷酸甘油醛基因GAPDH为内参基因，设计合成引物GAPDH1：5’AACATTGTGCCAACATCCA 3’与GAPDH2：5’-ACCCCATTCATTGTCATAC-3’。分别以白粉菌诱导的抗病葡萄株系白河-35-1，“6-12-6”，白河-13-1与感病葡萄株系白河-35-2，“6-12-2”，广西-2在不同时间提取的RNA反转录产物为模板，进行RT-PCR扩增。PCR扩增体系为：10 ×PCR 缓冲液 (Mg2+Plus) 2.5uL，dNTPs（2.5mM） 2uL，上游引物和下游引物各 1 uL, rTaq 0.125uL，反转录产物 1uL，超纯水补齐至 25uL。PCR反应条件为：预变性94℃ 3min；进入如下循环：94℃ 30 S，Tm 52℃ 30 S，72℃ 1 min；25个循环；72 ℃ 延伸 10 min ,4 ℃保存。取 10 uL 的 PCR 产物在1 %琼脂糖凝胶中电泳 , 观察PCR产物条带的强度，从而获得该基因的表达特征。2.结果与分析
2.1中国野生华东葡萄白河-35-1 总RNA的提取
采用改进的SDS/酚法提取样品RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳（图1），结果表明， 28 S 和18 S 条带清晰，亮度和宽度均为2∶1，表明所提取的总RNA完整，没有降解。同时，Nanodrop检测结果D260 nm/D280 nm为1.8～2.0，RNA纯度较高，可以用于反转录实验。
图1 白河-35-1总RNA提取
Fig.1 Extraction of BaiHe-35-1 total RNA
2.2中国野生华东葡萄白河-35-1 VpUSP基因全长序列的获得
以接种后0、6、12、24、48、72、96h的 RNA等量混合为模板，根据Clontech公司RACE试剂盒说明书要求进行RACE-PCR（图2），获得5'端cDNA序列180bp和3'端cDNA序列900bp的PCR产物，经克隆测序后生物论文，利用DNAstar 软件进行拼接获得了中国野生华东葡萄白河-35-1 VpUSP基因836bp的全长cDNA序列。
图2VpUSP cDNA片段的RACE-PCR产物凝胶电泳
M：DL2000； 5：5′RACE扩增产物，3：3′RECA扩增产物
Fig.2.Electrophoresis of RACE-PCR product of VpUSP cDNAfragments
M, DNA markerDL2000; 5,5'RACE-PCR product; 3, 3'RACE-PCR product.
在获得了中国野生华东葡萄白河-35-1VpUSP基因全长序列的基础上，通过NCBI的ORF finder 程序对获得的目标基因进行了开放阅读框分析，结果如图所示，VpUSP基因全长836bp，开放阅读框为528bp，编码176个氨基酸（图3）。
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GP F Q R V F V G T VS E F C
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图3 VpUSP基因cDNA及推测的氨基酸序列
Fig 3 Sequences of VpUSP cDNA and its deduced amino acids
2.3中国野生华东葡萄白河-35-1 VpUSP基因的系统进化树分析
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