论文导读:：从海南温泉中分离到一株对香蕉枯萎病病原菌4号小种有强拮抗作用的链霉菌菌株HW1，对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化及16SrDNA序列分析。其内生菌丝无横隔、不断裂；孢子圆形，簇聚在气生菌丝上。在PDA 培养基上，菌落生长开始为白色，培养成熟后，气丝逐渐由白色变灰，最后因为产生孢子变为褐色，并可产黄色可溶色素。以16S rDNA序列为基础构建了菌株HW1的系统发育树，其与模式链霉菌株的16S rDNA序列的同源性为99%。初步将该菌株鉴定为Streptomyces costaricanus。HW1菌株和香蕉枯萎病病原菌4号小种在土壤中的共培养试验表明，HW1菌株在45℃温度的生长环境中，表现出对香蕉枯萎病病原菌较好的抗性。
论文关键词：香蕉枯萎病，链霉菌HW1，分离，鉴定，共培养
香蕉枯萎病又名香蕉巴拿马病、黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型 ( Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)侵染而引起维管束坏死的一种毁灭性香蕉土传病害。近一个世纪来，国内外一直致力于香蕉枯萎病的化学药剂筛选，但目前还没有一种理想的化学药剂。关于香蕉枯萎病生物防治的研究则刚刚起步。目前已报道分离到对香蕉枯萎病菌有较强抑制作用的拮抗菌有绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）[1]、荚壳布克氏菌（Burkholderiaglumae）[1]、哈兹木霉（Trichodermaharzianum）[2]、荧光假单孢杆菌（Pseudomonasfluorescens）[3]、芽孢杆菌[4]、玫瑰浅灰链霉菌(Streptomyces roseogriseolus)[5]、灰肉色链霉菌(Streptomycegriseocarneus)[6]、橄榄产色链霉(Streptomyces olivochromogenes)[7]、Streptomyces violaceusniger[8] 等。但香蕉枯萎病生防菌的田间规模应用还有待进一步研究和探索。同时，香蕉枯萎病抗病品种的培育也有了一定的进展，如台湾的抗枯5号的抗病性较好。笔者认为，抗病品种和生物防治相结合是解决香蕉枯萎病的重要途径。
链霉菌是一类在自然界尤其是在土壤中广泛存在的微生物，能产生多种代谢物质抑制植物病害，而且绝大多数链霉菌对人体无害。本文报道了从海南温泉中分离筛选出一株产几丁质酶、对香蕉枯萎病有较好拮抗作用的链霉菌HW1，对其进行了形态特征、生理生化鉴定以及基于16S rDNA序列的系统发育分析。并对该菌株产几丁质酶性质及其耐热性进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源
菌株HW1系本实验室从海南温泉中分离得到；香蕉枯萎病病原菌4号小种(FOC4)由本实验室保存。
1.1.2 培养基
使用的培养基包括：几丁质培养基、土豆葡萄糖培养基（PDA）、高氏一号培养基、燕麦片琼脂培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、 NA培养基、甘油天门冬酰胺琼脂培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、明胶液化培养基、淀粉水解琼脂培养基、牛奶凝固与胨化培养基、纤维素水解培养基、柴斯纳琼脂培养基、尿素水解培养基、 硝酸盐还原培养基、黑色素产生培养基。培养基配制参照陈天寿[9]方法。
碳源利用的培养基配方：（NH4）2SO4 2g，MgSO4?7H2O0.2g，NaH2PO4?7H2O 0.5g，K2HPO4 0.5g，CaCL2?2H2O0.1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。待测物：L-阿拉伯糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖、乳糖、山梨醇、甘油、醋酸钠、柠檬酸钠和淀粉，按1%的量添加。
1.2 菌株的分离
从海南省琼海市官塘温泉中，取若干的温泉水，用无菌的蒸馏水稀释，分三个梯度，用几丁质培养基涂布平板，培养6d共培养，挑选菌株，再用初筛得到的菌株进行纯化获得单菌落。分离到的单菌落用对峙实验法进行抗香蕉枯萎病的拮抗菌初筛，根据抑菌圈大小挑选菌株论文网。然后将初筛得到的菌株进行液体摇瓶发酵后，用打孔法复筛，具体方法为：用无菌的打孔器在直径9㎝的PDA培养基平板上打孔，每板4孔。然后用无菌棉签将香蕉枯萎病菌均匀涂布于打孔的PDA培养基平板上，孔中滴加初筛菌株的发酵液，28℃培养3-5天后观察抑菌圈。根据抑菌圈大小筛选出抗香蕉枯萎病的的强拮抗菌株。
1.3 拮抗性检测
用对峙实验法测定菌株HW1对香蕉枯萎病病原菌的拮抗抑制作用，即在PDA培养基的中央接种香蕉枯萎病病原菌，在距离病原菌菌落约2cm处用接种针接种少量待测菌。28℃培养3-5天，观察待测菌的抑菌情况。
1.4 形态特征和培养特征
于PDA 培养基上28℃培养7d，观察孢子丝和基内菌丝的形态。参考文献[10,11]中所推荐的常用培养基，28℃培养7-14d，观察培养特征。
1.5 生理生化特征
参考文献[11] 对HW1进行生理生化测定实验。
1.6 16S rDNA 序列的分析
参照文献[12]的方法提取菌株HW1的基因组总DNA，用引物A (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和引物B (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)作为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液 5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL ，dNTP(10mmol/L)1μL，引物A/B（20μmol/L）1μL，模板DNA 1μL，Taq酶0.5μL，无菌水36.5μL。PCR 扩增条件: 95 ℃ 3min ；95 ℃ 45sec， 50 ℃ 45sec，72 ℃ 90sec，30个循环；72 ℃ 10min。
PCR产物经纯化后，送由大连宝生物公司测序。将测序结果用BLAST软件与GenBank中的相关属种的16S rDNA序列进行比较，并用DANMAN5.1软件中的MultipleSequence Alighment 进行同源性分析，并构建该菌株的系统发育树。
1.7 HW1菌株和香蕉枯萎病原菌4号小种在土壤中的共培养试验
考虑到在实际应用中，枯萎病病原菌和拮抗菌的相互作用是在土壤中进行的，因此，我们在土壤中共培养病原菌和拮抗菌，以检验在营养胁迫的情况下，拮抗菌是否对枯萎病病原菌的生长有抑制作用。具体方法如下：首先，将病原菌菌剂按2%的接种量和置于三角瓶中已高温消毒的土壤混合，在控制湿度的情况下培养一个月，使病原菌在土壤中充分生长；然后，将培养好的拮抗菌菌剂按0.1%的接种量接入该土壤中，充分混匀后继续培养；最后，在培养一个月后，取少量共培养的土样通过涂布分离的方法来分离微生物，观察病原菌和拮抗菌的生长情况。同时，做好严格的无拮抗菌的对照。分离所使用的培养基为：PDA培养基(添加了100μg/mL的Amp和Kan)。
另外考虑到HW1是从温泉中分离得到的，该菌株可能在较高的温度（50℃左右）生长良好，并在这种条件下对枯萎病病原菌的抑制作用更强，因此共培养，本研究还进行了在不同温度条件下的共培养试验。
2 结果
2.1 温泉水样中香蕉枯萎病拮抗菌的分离筛选
一些微生物所产生的几丁质酶能降解真菌细胞壁的主要成分几丁质，从而破坏真菌的细胞壁，使病原菌细胞生长受阻。另外几丁质酶还可破坏病菌菌丝尖端新合成的几丁质，从而使菌丝停止生长、粗缩畸形甚至解体消解。因此本研究中采用几丁质培养基来分离微生物，希望以此来富集一些能拮抗香蕉枯萎病的微生物。利用几丁质培养基从温泉水样分离得到的微生物菌落共有10个，对香蕉枯萎病病原菌有强拮抗作用的有3株，经对峙实验表明HW1对香蕉枯萎病病原菌的拮抗作用最强（图1）。于是，对HW1菌株进行了生理生化和16S rDNA序列分析鉴定。
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