论文摘要：香蕉果实是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官，构建能在香蕉果实中高水平表达异源蛋白质的表达载体是必需的。而一个高效表达的载体，启动子是其最重要元件之一，因此，果实特异性表达启动子的获得是香蕉作为生物反应器的前提。香蕉凝集素是一种在香蕉果实中大量存在的蛋白质，其基因被证明在果肉组织中大量表达。利用染色体步移法克隆到香蕉凝集素基因5’端上游的一段长670bp的序列远端344bp，共获得该启动子序列1014bp。通过Promoter predictions、PlantCARE等软件进行基础启动子区及调控元件分析，表明在BanLec启动子1014bp序列中有三处基础启动子区，且比670bp香蕉凝集素基因启动子具有更多的组织特异性表达调控元件(CAATBOX1在-998、-679)、低温抗寒调控元件（MYCCONSENSUSAT在-690、-684处）、伤害调控元件（WBOXNTERF3在-871、-743）和ABA等激素应答及作用相关的元件（DPBFCOREDCDC3在-838，ABRE在-818）。利用该序列置换植物表达载体pCAMBIA1304上的35S启动子构建植物融合表达载体，然后用基因枪转化香蕉根、叶和果实，GUS基因和GFP基因瞬时表达证明，该启动子为果实特异表达启动子，且启动活性高于原有的670bp启动子。
论文关键词：香蕉,香蕉凝集素基因,启动子,果实特异表达
果实作为植物的生殖器官含有丰富的营养成分，有着特殊的商业价值，而且果实对植物的繁衍有着非常重要的作用，研究果实特异性启动子对我们了解果实的发育过程及启动子的调控机制有着重要的理论意义。
香蕉凝集素（Bananalectin,BanLec）是在成熟香蕉果实中的一种主要蛋白，RT-PCR及竞争性PCR的方法研究凝集素基因在香蕉不同器官中的表达，实验结果表明香蕉凝集素基因只在果肉中表达，而且随着采后成熟过程而表现出发育特异性，在成熟度IV的果肉中，表达量最高，每微克总RNA中包含有68ngBanLec基因的转录本。据此克隆了BanLec基因5′上游的启动子序列670bp，通过构建携带gus基因的植物融合表达载体，转化香蕉不同组织以检测启动子特性，证明BanLec基因启动子是果实特异表达启动子（专利号ZL2.4）。利用该启动子构建葡萄芪合酶基因融和植物表达载体，转化番茄显示目的基因表达产物只在果实中表达。为了更加深入研究该启动子结构特点及功能，本研究利用GenomeWalker方法分离该启动子上游序列，并对该序列进行分析、鉴定。以期获得启动活性更强的启动子，用于今后的转基因研究。
1．材料和方法
1．1实验材料和试剂
1．1．1实验材料香蕉果实采自热带生物技术研究所实验基地。
1．1．2试剂UniversalGenomeWalkerKit购自基因公司（GeneCompany），其它试剂购自华美公司。
1．2实验方法
1.2.1凝集素启动子的分离
1.2.1.1香蕉基因组DNA的提取参照傅荣昭的方法。
1.2.1.2香蕉凝集素启动子扩增
准备4个1.5mL的离心管，放入2.5ug香蕉基因组DNA，分别用DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ进行酶切。按UniversalGenomeWalkerKit提供的方法对酶切产物进行纯化。纯化后基因组DNA与GenomeWalkerAdaptors连接。
根据我们克隆已申请专利的BanLec基因启动子序列，按照UniversalGenomeWalkerKit的要求在5’端设计两个特异引物：
Primer15’-TGTGGAGTACCACCGCTGCCGTAGTGT-3’
Primer25’-TCCGTTCCCTCCCCATGCTCCCACCTTGAT-3’
依据UniversalGenomeWalkerKit提供的方法及反应条件，利用特异引物Primer1、Primer2与试剂盒提供的接头引物进行第一轮和第二轮PCR。
1.2.2序列测定与分析
扩增片段与pGEM-TEasyVector连接，得到pGEM-T-Lec载体，转化E.coliDH5α,筛选重组子酶切鉴定，于上海生物工程公司测序；根据新扩增序列与原有670bp序列拼接设计全长序列引物，从基因组DNA扩增1041bp启动子序列连接pGEM-TEasyVector，命名为pGEM-T-Lec1，对该序列测序，并利用Promoterpredictions、PlantCARE软件进行启动子功能预测。
1.2.3植物表达载体p1304BanLec构建
根据测序结果及酶切位点分析，设计该启动子序列5’和3’PCR扩增引物Primer3和Primer4，并分别加上BamHⅠ和SpeI酶切位点：
Primer35’-GGGGATCCCCCAAAATAACATCGTTAGAGAGG-3’
BamHⅠ
Primer45’-GGACTAGTTCGACGTCAACACATAACGCAC-3’
SpeⅠ
以pGEM-T-Lec1质粒DNA为模版进行PCR，PCR产物和pCAMBIA1304质粒DNA分别用BamHⅠ和SpeⅠ进行双酶切。酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，回收经酶切的PCR产物（约1000bp）和pCAMBIA1304酶切产物的大片段（约11kb）。将回收的PCR产物及pCAMBIA1304酶切大片段连接获得含有凝聚素启动子植物表达载体p1304BanLec，BamHⅠ和SpeⅠ进行双酶切鉴定，测序。
1．3基因枪法对香蕉不同器官转化p1304BanLec及绿色荧光蛋白、gus基因的组织化学染色定位
将香蕉果实用1‰氯化汞溶液浸泡10min,用灭菌蒸馏水冲洗数次再将其徒手切成大小0.5cm、厚度0.5-1mm的薄片；纵剖香蕉组培苗的根并将叶切为0.5-1cm小块。将根、叶片和果实薄片均匀置于1/2MS培养基上室温放置3h，每皿约放置40块，重复6皿。按照Jefferson等人的方法，以HO包被的微弹为阴性对照，pCAMBIA1304质粒DNA包被的微弹为阳性对照，本实验克隆的BanLec启动子序列1014bp的p1304BanLec质粒DNA包被的微弹和此前已获得的BanLec启动子序列670bp的PBIL2质粒DNA包被的微弹分别轰击香蕉根、叶和果实簿片。 1/3 1 2 3 下一页 尾页 |
