| 本试验着重对CTAB法进行了改良。以幼嫩叶片为试验材料，不同处理方法提取的总RNA经进行紫外分光光度计测定，结果见表2、表3。综合表2、表3显示当PVP浓度为2%时，RNA的平均产率为243.25μg·mL-1显著高于浓度为4%、8%时的产率209.25μg·mL-1、174.67μg·mL-1,,随着PVP浓度的升高，RNA纯度逐渐增高，但RNA产率却开始下降，说明PVP在去除多酚等杂质时，使RNA也被结合而丢失了，但其OD260/OD230和 OD260/OD280的比率都在2.0左右。PVP与酚类化合物(特别是原花色素类物质)形成鳌合物，使之不能成为多酚氧化酶的底物而抑制它们的氧化。3种不同浓度的PVP所获得的第一次抽提产物的颜色比较见图4。图4结果表明，PVP可以有效地防止底物的褐化多糖，结合表2本实验表明PVP的浓度在2%时无论是RNA产率，还是OD260/OD230和 OD260/OD280的比率都是最理想的。所以在能保证RNA质量的前提下，应适当降低PVP的浓度，试验认为2%即可作为PVP的适宜浓度。2%和4%β-巯基乙醇两个处理中RNA产率变化不显著，但4%处理可明显提高RNA的纯度，所以本试验认为β-巯基乙醇最适浓度为4%。
表2 不同组合提取RNA的结果比较
Table2 Comparison of RNAisolation from Robinia pseudoacacia ‘Idaho’ by different treatments of improved CTAB method
|
编号No
|
D260/280
|
D260/230
|
浓度/(μg·mL-1) concentration
|
|
1
|
1.32
|
0.69
|
256.80
|
|
2
|
1.94
|
1.74
|
236.70
|
|
3
|
1.89
|
1.82
|
201.30
|
|
4
|
1.75
|
1.63
|
265.90
|
|
5
|
1.94
|
1.89
|
253.30
|
|
6
|
2.13
|
2.05
|
211.30
|
|
7
|
2.57
|
2.47
|
200.60
|
|
8
|
2.08
|
2.14
|
190.30
|
|
9
|
2.11
|
2.06
|
173.70
|
|
10
|
1.99
|
2.87
|
247.20
|
|
11
|
2.15
|
2.98
|
210.40
|
|
12
|
2.09
|
2.45
|
159.70
|
|
13
|
1.94
|
2.17
|
260.10
|
|
14
|
1.91
|
2.01
|
198.90
|
|
15
|
1.97
|
1.96
|
142.10
|
|
16
|
1.99
|
2.81
|
228.90
|
|
17
|
2.02
|
2.78
|
165.90
|
|
18
|
2.1
|
2.13
|
159.90
|
表3 不同处理提取RNA平均纯度、产率及其差异显著性
Table3 The average purity and concentrationof RNA isolated from leaves by different treatments of improved CTAB method
|
处理
Treatment
|
D260/280
|
D260/230
|
浓度/(μg·mL-1) concentration
|
|
抽提2次
|
1.83b
|
1.64b
|
237.55a
|
|
抽提3次
|
2.17a
|
2.50a
|
196.98b
|
|
抽提4次
|
1.99b
|
2.31a
|
192.63b
|
|
2% PVP
|
1.93a
|
2.11a
|
243.25a
|
|
4% PVP
|
2.01a
|
2.26a
|
209.25b
|
|
8% PVP
|
2.05a
|
2.08a
|
174.67b
|
|
2%巯基乙醇
|
1.97a
|
1.90b
|
206.72a
|
|
4%巯基乙醇
|
2.02a
|
2.48a
|
211.39a
|
table11 
图4 3种浓度的PVP获得的第一次抽提产物的颜色比较
Fig·4 Comparison of colors of the first coarse extracts with different concentration of PVP
4-1 2%PVP4-2 4%PVP4-3 8%PVP
图5 不同抽提次数产物的颜色比较
5-1抽提一次 5-2抽提两次 5-3抽提三次
Fig·5 Comparison of colors of different times of extraction
5-1extraction byone tme 5-2 extraction by two tmes 5-3 extraction by three tmes
据测定，香花槐茎叶中分别含粗蛋白21%-25%，是一种速生、高产、优质的木本饲料[10][10]。在提取的过程中应该加强对蛋白的去除，防止蛋白对下游工作的影响，因此本实验选用增加抽提次数来比较蛋白的去除，结果如图5和表2，表2显示随着抽提次数的增加RNA含量会有所降低，但其OD260/OD230和 OD260/OD280的比率是越来越理想（2.0左右），图5也表明不同抽提次数的离心产物也显示越来越透明澄清。考虑到RNA的得率及其OD260/OD230和 OD260/OD280的比率，所以选择抽提次数2次为最适的抽提次数。
综合以上结果，对香花槐而言，改良CTAB法的最适提取液组成为: 2%CTAB, 4mol/L异硫酸氰胍，100mmol /L Tris-HCl ( pH8.0 )，20mmol/L EDTA(pH8.0), 2% PVP, 4%β-巯基乙醇。在抽提过程中选择抽提次数2次，在以下香花槐茎皮和叶片组织的改良CTAB法中均采用此方法。
2.3不同组织的RNA提取方法比较
以改良的TRIZOL法提取香花槐根皮，以改良CTAB法提取香花槐叶片和茎皮结果如下图6。图中显示提取的RNA28S条带的亮度约是18 S条带的两倍，蛋白、多酚及多糖类等杂质污染较少，均符合后续分子生物学的试验要求中国期刊全文数据库。
图6不同方法提取香花槐不同器官与组织的总RNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig·6 Agarose gel electrophoresisof total RNA isolated from different tissues or organs with different methods
M：mark；1:改良Trizol试剂法提取根皮; 2,3:改良CTAB法分别提取的叶片和茎皮
3 讨论
由于不同植物或同一植物不同组织的组成成分差别较大多糖，所以对于不同植物或同一植物不同组织的RNA提取方法也有所不同[5][4]。
3．1 RNA提取需要注意的问题 实验过程中要严格控制无酶的环境，所用试剂都需要灭酶处理，实验人员要带一次性手套和口罩，整个过程尽量在超净台工作，超净台要提前30 min用紫外灯照射消毒，以减少RNase的污染。液氮研磨过程中要研磨彻底，否则影响细胞的破裂完全，提出的RNA量少或提不出。特别对于比较坚硬的根皮组织可以事先在液氮中冷冻两小时以上再研磨。
3．2 防止酚类氧化 香花槐含有大量酚类化合物，在提取过程中十分容易氧化，导致提取过程中组织颜色逐渐加深变成褐色，严重影响了所提的RNA的质量，其主要原因是由于酚类化合物氧化后不可逆地结合到核酸上并与RNA共沉淀[12][11]。为解决酚类氧化问题，用β-巯基乙醇作为还原剂[13]，用PVP作鳌合剂能够提高RNA的质量，减轻氧化而产生的背景颜色。
3．3 克服蛋白质污染 香花槐含有大量的蛋白，尤以茎叶组织中蛋白含量较多，在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂，如异硫酸氰胍、盐酸呱、巯基乙醇, 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)等使蛋白质变性完全,细胞裂解彻底，从而将RNA完全释放出来，同时可去除大部分蛋白质，最后再用苯酚/氯仿多次抽提除去残存的蛋白质和DNA。
经过上述改良的Trizol试剂法、CTAB法产率和质量均有显著改善，而且在香花槐的不同组织材料中具有较好的适用性。既使有适宜的方法，试验材料也会对RNA的提取造成很大的限制多糖，应根据试验要求选择适宜的材料，以达到最佳效果。本实验于4月中旬，以香花槐幼嫩组织为试材提取RNA，产率和质量均较高。
参考文献
[1] JUNFAR.香花槐[EB/OL].(2005--10--05) [2006--01--20].http://www.landscape66·com/plant/ahiwu/200510/3526·html.JUNFAR.Robiniapseudoacacia‘Idaho’[EB/OL].(2005--10--05)[2006--01--20].http://www.landscape66·com/plant/ahiwu/200510/3526·html
[2] 刘昀，李凤霞，郑易之，郝东时，高天舜，朱冬梅，何孟元. 香花槐组培苗快繁体系的建立及工厂化育苗的主要影响因素[J]. 应用与环境生物学报. 2004, 10(2): 162-165.
[3] 李宏，王新力. 植物组织RNA提取的难点及对策[J]. 生物技术通报. 1999, 15(1): 36-39.
[4] Yoshida K, Baba K,Yamamoto N, et al. Cloning of a lectin cDNA and seasonal changes in levels ofthe lectin and its mRNA in the inner bark of Robinia pseudoacacia[J]. Plant MolBiol. 1994, 25(5): 845-853.
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[9] 徐进，李帅，施季森. 鹅掌楸属植物总RNA提取方法的比较与分析[J]. 福建林学院学报. 2008, 28(2): 156-159.
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[11] Fang G H S G R. A quick andinexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J]. BioTechniques. 1992(13): 52-56.
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