论文导读:：为探索香花槐各组织总RNA提取的最佳方法，以实验苗圃中的香花槐为实验材料，在比较了Trizol试剂法和常规CTAB法的基础上，建立了香花槐不同组织的最适提取方法。改良CTAB法利用高浓度的β-巯基乙醇和合适浓度的PVP来防止RNA提取过程中多酚的氧化，然后增加苯酚/氯仿抽提次数来去除香花槐叶片和茎皮过多蛋白质。改良Trizol试剂法在根皮中加PVP研磨成白色粉末，可以有效地防止反应液褐化。各组织优化方法经琼脂糖凝胶电泳检测，所提取的总RNA的28S、18S条带清晰明亮，无降解；其A260 nm/A280 nm值为2.0，表明提取的总RNA质量较好。
论文关键词：香花槐，多糖，多酚，总RNA，组织
1996年从朝鲜引入中国[1](JUNFAR．香花槐[EB／OL]．(2005-10-05)[2006-01-20]．http：llwww．1andscape66．com／plant／ahiwu／200510／3526．htm1．) 。香花槐速生，花紫红色，总状花序壮观，开花时间5—7月，花期长；根系强健，萌蘖更新能力强，有根瘤菌，能固氮，耐旱耐瘠薄，也耐盐碱多糖，喜沙质土壤，并可有效地保持水土，改善生态环境。是城市绿化、美化、沙化及流域治理、荒山荒地生态修复的先锋树种[2][1]。在基因水平上了解该树种生长发育；开展遗传转化品种改良的研究已得到了重视。相关分子生物学和工程技术研究，Northern杂交分析、体外翻译或cDNA文库建立、RT-PCR及表达差异分析等亟高质量的RNA[3][2]。
植物组织总RNA提取方法的报道很多, 且Yoshida曾报道香花槐凝集素cDNA的克隆，这为香花槐不同组织RNA提取方法的建立和优化提供了丰富资料[4][3]。同时考虑到植物组织特异性，不同材料甚至同一材料不同发育阶段，RNA的提取方法也不尽相同[5-7][4-6]。本文以香花槐根、茎、叶等不同器官为试材，以Trizol、CTAB等提取方法为基础建立和优化其RNA提取方法，为其分子生物学研究和生物工程技术需要奠定基础中国期刊全文数据库。
1 材料和方法
1.1材料和试剂
1.1.1 材料
供试材料香花槐（Robiniapsuedoacacia ‘Idaho’）采自为北京林业大学生物中心苗圃。4-5月，植株萌芽生长，采集嫩叶、茎和根部皮层和幼嫩根尖，液氮冷却、－80 ℃贮存备用。
1.1.2 主要试剂配制
DEPC水:体积分数为0.1%；CTAB裂解缓冲液；苯酚、氯仿、异戊醇25：24∶1(体积比)混合； 75%的乙醇(v/v)；LiCl 10mol/L；SSTE溶解液(DEPC水配制)。
1.1.3 试验用品处理
实验中所用的玻璃器皿与用具均在180℃下烘烤12 h，塑料制品在含0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)的水中，37℃浸泡12 h，然后121℃灭菌30 min，60℃烘干备用。
1.2提取方法
1.2.1 TRIZOL法 TRIZOL试剂购自Invitrogen公司，其RNA提取方法参照Invitrogen公司的试剂说明书，得到的总RNA溶于适当的 DEPC水中。
1.2.2改良TRIZOL法 考虑到植物组织中多酚类和多糖物质的含量高，细胞破碎后极易被氧化成红褐色物质，与核酸不可逆地结合[8][7]干扰RNA提取，在上述TRIZOL法基础上，在研磨幼嫩根皮过程中，加入2%的PVP多糖，在抽提过程中加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇25：24∶1(体积比)混合液进行抽提。
1.2.3改良CTAB法 在徐进[9][8]方法基础上，以幼嫩树皮为试验材料，针对香花槐组织本身蛋白质含量高的特性[10]『10』，对β-巯基乙醇、PVP最适浓度以及用等体积的苯酚、氯仿、异戊醇25：24∶1(体积比)抽提去蛋白的次数进行了摸索，各比例设计见表1。
表1 香花槐总RNA提取方法
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编号No
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抽提次数
Times of extraction
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β-巯基乙醇(% )
Concentrations of
β-mercaptoethanol
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PVP(% )
Concentrations
Of PVP
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1
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2
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2
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2
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2
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2
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2
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4
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8
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Total RNA isolation basedon CTAB method in Robinia pseudoacacia ‘Idaho’
.3 RNA完整性分析
从表1所述方法得到的RNA中取6 uL进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.4 RNA得率及纯度
以微量分光光度计（SMA3000型）测量RNA样品的OD260、OD230、OD280和RNA浓度,以OD260/OD280、OD260/OD230的比值检测RNA纯度。按照以下公式计算RNA产率：
产率（μg/ g）=样品浓度(μg/ml)×N(样品稀释倍数)×V(体积) /样品重(g)
本实验用相同质量的组织为研究对象，同时提取后的RNA溶解于相同体积的DEPC水中，因此样品浓度的大小就反应了个组织材料的产率大小。
2结果与分析
2.1 2种TRIZOL法提取RNA的比较
RNA的完整性：总RNA的主要成分是28S RNA和18S RNA，因此，根据琼脂糖凝胶电泳图上28S和18S RNA的完整性可以判断RNA有无降解及有无DNA污染。 图1显示，Trizol法提取的总RNA样品只有根组织有条带，28S rRNA条带亮度与18S rRNA几乎一致，没有呈现出28SrRNA条带亮度为18S rRNA条带亮度2倍的状况；茎和叶片提取的总RNA无清晰条带出现，而点样孔周围亮，可能有大片段DNA污染；该方法不适合用于提取香花槐RNA。
改良Trizol法，在根皮中加入PVP研磨，粉末白色，有效防止褐化（图3）这是由于Trizol试剂中含有苯酚，它是一种强氧化剂，能将根皮组织中的多酚类物质氧化，从而发生了褐化效应反应[11][9]。在本研究中发现Trizol一次法并不能非常完整有效地去除细胞中的蛋白质，在第1次沉淀溶解后，再用氯仿重新抽提1次获得的RNA。同时，为了除多糖和蛋白成分更彻底多糖，增加了在抽提过程中加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇25：24∶1 (体积比)混合液，28 S和18 S条带均清晰可见，且条带明亮，28 S条带的亮度约是18 S条带的两倍，说明提取的RNA无降解，质量好，且无DNA污染（图2）。图2表明，常规Trizol法提取的根组织总RNA样品，在琼脂糖凝胶电泳点样孔附近显示明亮条带，说明有大分子蛋白或DNA污染中国期刊全文数据库。与此相比，改良TRIZOL法去除了根皮总RNA提取的干扰，提取效率高，为香花槐根皮总RNA提取的首选方法。
图1 TRIZOL法提取香花槐各组织的总RNA凝胶电泳
1,2根皮 ；3,4枝皮 ；5,6叶片
Fig·1 Agarosegel electrophoresis of total RNA isolated from different tissues w ith Trizolmethod
1,2 1,2根皮 Roots；3,4枝皮Barks ；5,6叶片 Leaves
图2 2种Trizol法提取香花槐根皮组织的总RNA凝胶电泳
1改良Trizol法; 2 Trizol法
Fig·2 Agarose Agarose gel electrophoresis of total RNAisolated from different tissues w ith two trizol method
1 1改良Trizol法improved Trizol method；2Trizol法 2 Trizol method
图23改良Trizol法中根皮与裂解液作用的结果
3-1加PVP裂解粗提物 3-2不加PVP裂解粗提物
Fig·2 3 Comparison of colors of coarse extracts by improved Trizol method
3-1 2-1加PVP裂解粗提物2%PVP；2-2不加PVP裂解粗提物 3-2 No PYP
2.2提取香花槐RNA的改良CTAB法
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