论文导读:：习称荆半夏【2】。叶双凤等【4】成功的利用组培时产生的胚性愈伤组织。石蜡切片制作与观察。小块茎？还是先形成体细胞胚再分化成小块茎。
关键词：荆半夏，愈伤组织，石蜡切片，体细胞胚
半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）为天南星科半夏属植物。以块茎入药，为我国传统中药材，全国20多个省(市)均有分布，主产四川、湖北、贵州、河南、 安徽、山东、浙江等省[1]。湖北荆州地区和流经湖北境内的汉水流域所产半夏，以色白、质坚实、粉性足而被誉为上品，蜚声海内外，习称荆半夏【2】。半夏繁殖器官有块茎、珠芽和种子【3】，以块茎繁殖会影响药材产量，以珠芽繁殖因随着半夏植株的倒苗而不易收获，以种子繁殖因其结实率低下而无实际意义。因此，有研究者希望通过组培快繁用于扩大种植，但组培苗的炼苗及移栽成活率低等问题使其推广应用还不成熟，叶双凤等【4】成功的利用组培时产生的胚性愈伤组织，运用激素调控技术，使胚性愈伤组织直接产生小块茎而不形成实生苗（是直接通过器官发生途径形成，小块茎？ 还是先形成体细胞胚再分化成小块茎，对这一科学问题 没有论述清楚？？），以达到半夏人工种茎的工厂化生产，为半夏种源的大规模提供成为可能。了解胚性愈伤组织形成的体细胞胚如何朝着小块茎方向发展，以及细胞形态学变化体细胞胚，这对采取人工控制措施，调节胚性愈伤组织大量形成小块茎至关重要，笔者以取自于湖北省京山县的野生荆半夏为材料，进行了胚性愈伤组织的细胞形态学观察，旨在揭示半夏离体培养体细胞胚的发生规律，探索高频率体细胞胚发生的控制节点，为指导半夏人工种茎的工厂化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1实验材料
采自湖北省京山县野生荆半夏，由湖北省中医药研究院王克勤研究员鉴定为天南星科半夏属植物半夏中国期刊全文数据库。
1.2 愈伤组织诱导及培养
取荆半夏如何界定“幼嫩”？（苗龄？叶的位置？）叶片和茎段（如何获取茎段外植体？）接种于愈伤诱导培养基（MS培养基上附加NAA 0.2mg/L ，6-BA 0.5 mg/L，PEG20 mg/L，琼脂7g/L，蔗糖30 g/L）上，温度27℃，湿度70%，[?]光照强度4000lx进行培养。
1.3 石蜡切片制作与观察
选取培养不同时间叶片和茎段的愈伤组织，参照赵俊等【5】方法，用FAA固定液（75%乙醇：冰醋酸=3:1）固定，24 h后取出修整使切面平整，置入梯度酒精脱水、浸蜡包埋。切片厚度4μm，番红固绿法染色，自然晾干后用中性树胶封片，显微镜观察并在NICON相机下拍照。
2 结果与分析
2.1 叶片愈伤组织的诱导及观察
接种3d的叶片表面有膨大迹象并发生卷曲(图1-1)，培养7d时，通过显微切片可以看到叶片表面细胞的细胞质变浓，核仁染色较深位于细胞中央，即表面开始发生细胞脱分化（图1-6），此时的细胞生长旺盛并快速分裂，之后分生细胞分裂形成分生细胞团，大量的分生细胞形成愈伤组织。13d后肉眼即可见愈伤组织(图1-2)，19d时有体细胞胚的生成（图1-7），21d开始长根(图版1-3、4)，29d体细胞胚有出芽迹象（图1-8）。观察发现,愈伤组织大部分产生于叶片表面,内部多为松散的组织。出愈伤的同时，在外植体叶片的表面伴随有胚胎发生，与其余细胞分隔开而形成明显的球形胚。
2.2 茎段愈伤组织的诱导及观察
接种6d的茎段切口处发生膨大现象，培养7d后通过显微切片可以看到茎段切口处的愈伤团，11d时肉眼可见愈伤组织，此时茎段切口处已有体细胞胚的形成（图1-10、11）。茎段产生愈伤组织的部位与叶片不同，其愈伤组织的产生主要在切口处，极少数产生于茎段表面。其出愈伤过程首先是切口处细胞启动脱分化，然后形成大量分生细胞团，进而在表层细胞形成体细胞胚（图1-17）体细胞胚，呈球形。
2.3 荆半夏胚性愈伤与非胚性愈伤的比较
荆半夏愈伤组织按形态可分为胚性愈伤与非胚性愈伤，胚性愈伤的组织结构紧密，呈翠绿色和绿色（图1-19），其上附着的小颗粒胚在适合的培养基上能直接发育成完整植株，切片观察可发现其细胞小，细胞质浓，细胞核大，染色深，分裂能力强（图1-21），培养一段时间能形成大量的体细胞胚。非胚性愈伤的组织结构疏散，容易分离，颜色偏白（图1-20），分化成苗的能力弱，细胞大，细胞质稀，细胞核小，染色浅，分裂能力弱（图1-22），后期形成体细胞胚的数量极少。偶有胚性愈伤与非胚性愈伤组织同时存在的现象（图1-18）。另外，以叶片诱导的愈伤组织产生的非胚性愈伤组织较多，而以茎段诱导的愈伤组织产生的非胚性愈伤组织较少中国期刊全文数据库。
3 结论与讨论
荆半夏叶片和茎段均能诱导产生愈伤组织，以叶片为外植体时，愈伤组织大多发生在叶表面，以茎段为外植体时，愈伤组织则发生于切口处，这与黄丹枫等【6】对同属天南星科的魔芋组培愈伤的描述相一致。荆半夏以茎段为外植体较以叶片为外植体更容易直接产生体细胞胚，接种培养11d左右即可在切口处形成，而以叶片为外植体时则需先于叶表面形成愈伤组织后，再在其上形成体细胞胚，需约19d，在时间上明显更长，且体细胞胚的数量也相对较少，因此，实际操作过程中，应选择以茎段为外植体较为合适，并尽可能将茎段切得较短为宜。根据愈伤组织上的体细胞胚形成及小块茎的发生形态学特征观察，诱导形成体细胞胚后很快即可形成小块茎，在愈伤组织上的体细胞胚形成后即转瓶至种茎成熟诱导培养基上，对于促进种茎成熟至关重要。
荆半夏胚性愈伤与非胚性愈伤的形态鉴别，未见文献报道，参考李康【7】等对黄芩愈伤组织培养及细胞形态学观察体细胞胚，荆半夏的胚性愈伤组织细胞小，核较大，细胞质浓，核质比高，能形成体细胞胚，而非胚性愈伤组织的细胞大，核小，细胞质不浓，染色较浅，一般不能形成体细胞胚。参考霍云谦【8】对甘草愈伤组织诱导及体细胞胚的发生研究、张书标【9】对花生体细胞胚胎发生的组织细胞学观察和刘振虎等【10】研究观察的紫花苜蓿愈伤组织及体细胞胚的细胞学结论，荆半夏胚性愈伤与非胚性愈伤组织在形态和结构方面，也均存在较大差别。
观察荆半夏体细胞胚的发生，结果发现：以在外植体表层细胞为多，胚的形状多为球形，球形胚外层细胞进行垂周分裂，内层细胞进行辐射状分裂使其体积增大，而罗成科等【11】在三叶半夏悬浮培养下的体细胞胚胎发生及植株再生中，对体细胞胚的形态描述除球形胚外，还观察到心形胚和鱼雷胚，通常这两种形状的体细胞胚一般只在双子叶植物中产生，单子叶植物中鲜有报道，笔者未观察到荆半夏体细胞胚有心形胚和鱼雷胚。荆半夏球形体细胞胚外周表皮呈现有规律的轮廓，成熟以后逐渐形成孤立化状态（图1-7）。荆半夏体细胞胚胎发生是否为单细胞起源，有待于深入研究。
参考文献：
[1]马开森，丁季春，钟国跃等不同来源地的半夏种源对比栽培试验中国中药杂志，2004，29（2）：184-185
[2]马维平，黄连超，顾红卫等荆半夏组织培养及快速繁殖的研究西北药学杂志，2006，21（2）：57-59.
[3]胡玉涛，王沫，肖平阔.半夏的生物学特性研究概况[J].湖北林业科技，2006，142：38-41.
[4]王沫，叶双凤.半夏人工种茎的生产方法[P].中国专利,CN101491214, 2009-07-29
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[6]黄丹枫，刘佩瑛.魔芋再生植株形态发生途径的细胞组织学观察[J].上海农学院学报，1994,12（1）：25-30.
[7]李康，张东向，张磊等.黄芩愈伤组织培养及细胞形态学观察[J].齐齐哈尔大学学报,2007,23(1).
[8]霍云谦.甘草愈伤组织诱导及体细胞胚的发生[C].河北：河北农业大学，2005.
[9]张书标.花生体细胞胚胎发生的组织细胞学研究[J].广西农业生物科学，2002.21（1）
[10]刘振虎，卢欣石，葛军.紫花苜蓿愈伤组织及体细胞胚的细胞学观察[J].草业科学，2005,22（2）.
[11]罗成科，彭正松，陈卫民.三叶半夏悬浮培养下的体细胞胚胎发生及植株再生[J].西北植物学报，2006,26（4）：0842-0846.
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