论文摘要：本研究采用ILP标记分析了福建地区的20个亲本和30个育成品系构建的水稻籼粳亚种间杂交育种系谱的遗传多样性，并对结果进行聚类分析。结果表明ILP标记可明显区分供试材料的籼粳特征。基于ILP标记聚类结果，以相似系数0.67为阈值，将该育种系谱划分成3个类群。
论文关键词：水稻,育种系谱,聚类分析
水稻籼粳亚种间杂种一代蕴藏着巨大的杂种优势，福建农林大学作物遗传育种研究所进行了长期探索，认识到通过基因的不断聚合和累加，优良株型和高产与优质、抗逆性、适应性相结合是行之有效的选育实用型强优势籼粳亚种间杂交稻的育种策略，依据这一育种策略，构建了水稻籼粳亚种间育种系谱。
分子标记是检测种质资源遗传多样性的有效工具。常见的分子标记有：RFLP标记、RAPD标记、SSR标记、AFLP标记、CAPS标记、SNP标记、SSCP标记等，虽然它们各有许多优点，但都存在明显的不足之处。ILP（IntronLengthPolylnorphisms）标记即内含子长度多态性分子标记是基于己经测序的两个籼粳亚种基因组序列(Nippornbare和9311)上开发的一种新型分子标记，具有数量多(总数达5811个)、多态性高(在日本晴和9311之间为100%)、检测方便、结果稳定等优点，而且通用性好、单拷贝且共显性等优点。ILP标记作为一种新型的分子标记尚未有大量的报道。本研究利用ILP标记技术作为遗传多样性的研究手段探讨育种系谱的亲缘关系，对丰富分子标记在水稻遗传方面的应用和从分子水平揭示水稻类型均具有重要的理论意义，也为水稻超高产育种研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试材料
本研究以构建水稻籼粳亚种间杂交种质创新系谱中的20个亲本和30个不同阶段的育成品系为试验材料，用日本晴和93-11作为对照标记来揭示其遗传多样性。
1.1.2ILP引物
ILPs标记是根据已公布的籼稻品种9311和粳稻品种日本晴的全基因组序列开发的一种内含子长度多态性标记(Wangeta1.2005)，由吴为人教授惠赠。ILP引物从http://ibi.zju.edu.cn/ILPs/index.htm上获得籼粳特异引物，从5811个候选的ILP标记中研发出173个ILP标记，从中检测到60对ILP标记应用于水稻籼粳检测。引物合成来自上海生物工程有限公司（北京三博远志生物技术责任有限公司合成），自编号分别为1-62号，共124个引物。
1.2实验方法
1.2.1亲本叶片DNA的提取
采用CTAB法并加以改进。
1.2.2PCR反应体系的建立
在冰盒上建立ILP的PCR反应体系(15μL)。即模板：DNA(50ng/μL)2.0μL；dNTP：(2.5mmol/L)0.3μL；引物：(50ng/ul)1.5μL；TaqDNA聚合酶：(5U/μL)0.15μL；MgCl：(10mmol/L)0.75μL；10×PCRBuffer：1.25μL；双蒸水：9.05μL。
1.2.3PCR反应程序
94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s（每循环递解0.3℃），72℃延伸1min，10个循环：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸5min，4℃，保存。以上反应在PTC-200扩增仪上进行。
1.2.4电泳检测
PCR电泳检测：PCR扩增产物中加入3μL上样缓冲液，上样3μL，在DYCP-28D型电泳仪上进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶成分包括10%丙烯酰胺、0.04%过硫酸铵，0.1%TEMED，电泳缓冲液为0.5×TBE，250V电泳约1.5h。
1.2.5银染法显带，包括以下步骤：
将胶放入固定液（0.5%冰醋酸+10%乙醇），固定时间3～5min，放入0.2%AgNo3中染色8min；再用蒸馏水水洗1min，洗2次，放入0.375mol/LNaOH+0.4%甲醛中显色，显色至条带清晰；保存在双蒸水或保存在保鲜膜中可短期保存。DNA片断的分子量大小根据L-2000DNAMarker电泳迁移距离估计。
1.3统计分析方法
采用人工计带法进行电泳结果记录，清晰可辨的电泳条带全部用于统计分析。对于同一引物的扩增产物，按扩增条带的有无计数，迁移率相同的条带记为一个位点，扩增阳性赋值为“1”，阴性赋值为“0”，从而把图形资料转换成数据资料并输入EXCEL2000中建立特征数据矩阵用于进一步分析。应用DPS统计软件，根据Nei-Li计算法求得品种间的相似系数Sij，计算公式为Sij=2Nij／(Ni+Nj)，其中Nij为品种i和品种j共有的带数，Ni和Nj分别为第i和第j品种各自的带数。采用类平均法（UPGMA）对其进行聚类并作图。
2结果与分析
2.1ILPs引物筛选与扩增
ILP在野生稻中的遗传多样性具有典型的籼粳亚种特性，能反应籼粳亚种间的遗传多样性。用60对ILP引物对52份亲本材料(日本晴、9311及50份籼粳材料)检测，在52份材料中共扩增到124个条带，每对引物分别扩增到2-4条，平均为2.01个条带。45(61.4%)对ILP标记只检测到2种等位基因条带，即9311带型(TypicalIndicaAllele,)和日本晴带型（TypicalJaponicaAllele）。 1/2 1 2 下一页 尾页 |
