| PCR循环同上述RT-PCR反应。将PCR产物克隆到质粒pMD18-T载体中，经酶切鉴定重组子后测序。DNA测序由上海生工测序部完成。
1.2.6香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基氨基酸序列及其编码蛋白质的结构分析
利用DNASTAR、SMART和ClustlW等生物软件分析所得基因的核甘酸和氨基酸序列及编码蛋白质的结构特点，并与国际核酸和蛋白质数据库联网进行blast比较。
2结果与分析
2.13′RACE及5′RACE的扩增
利用反转录酶合成香蕉叶片的cDNA第1链，设计基因扩增特异引物进行5′RACE和3′-RACEPCR扩增（见图1）。结果分别获得约0.35kb和0.3kb的特异扩增条带。
A
2.2香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基全长cDNA的克隆
将3′RACE、5′RACE和已知片段进行电子拼接（VectorNTISuite10.0）最终得到香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的全长cDNA序列。以香蕉的叶片为材料提取作为模板的总RNA，根据拼接的序列设计5′端引物和3′端引物，进行RT-PCR反应，获得约0.8kb特异性扩增产物。对所获序列进行回收、连接、转化以及测序。其大小测序结果与预期一致。扩增结果见图2。
2.3香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组全长的扩增
以香蕉基因组DNA为模板,以特异性引物P1和P2扩增出香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组全长，约1.0kb（图3）。测序结果表明，该基因组序列长度为1017bp。
2.4香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基核苷酸序列及其推断的氨基酸序列分析
利用NCBI站点的ORFfinder对该序列进行分析，结果显示该基因的全长序列827bp，从第62bp开始至604bp含有1个开放阅读框（openreadingframe,ORF）和1个终止密码子，编码180个氨基酸（图4）。第1个起始密码子AUG紧跟其后的核苷酸为鸟嘌呤（G），符合Kozak规则。此外，在5′端有61bp的非编码区,在3′端含有223bp的非编码区（untranslatedregion,UTR），并且polyA多聚核苷酸结构上游还有1个典型的多聚腺苷酸加尾信号序列（TAAAA），上述特征表明，该序列是一个完整的香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因，将此基因命名为rbcs-mc。该cDNA全长在GenBank中的登陆号为EF556842。
利用DNAStar软件对其编码蛋白质的特征分析表明，编码的蛋白质的分子量大小为20.5ku，理论等电点（pI）为9.23，该蛋白质由20种氨基酸组成，原子组成是CHNOS。
以香蕉基因组DNA为模版，用跨rbcs-mc开放阅读框架（ORF）的PCR引物进行扩增，得到包括完整ORF框的DNA序列。将香蕉rbcS-mc基因的基因组DNA序列和cDNA全长序列的对比分析表明基因由3个外显子和2个内含子构成。它们的长度分别为182bp（exon1），95bp（intron1），130bp（exon2），95bp（intron2），231bp（exon3）。在外显子-内含子交接点处序列都显示出典型的内含子边缘特征序列“GT…AG”（图4），符合真核生物典型内含子的“GT…AG”法则。将序列提交GeneBank，GenBank登录号为FJ973633。
CGACGAGTCTTCTTCTTGATCTCGGGTCGAATTAGGTGAGTGTCAGAAAGAGGAATCAAC60
GATGGTTTCCTCCATGATGGTCTCCTCGGCTGCCACCTTCACCCGGGCTTCCCCGGCTCA120
MVSSMMVSSAATFTRASPAQ
ATCCAGCATGGTGGCGCCGTTCACCGGCCTCAAGTCCGCCTCCGCCTTCCCTGTCACCAG180
SSMVAPFTGLKSASAFPVTR
GAAGCCCAACGCCGACCTCTCCCACCTCCCCAGCAATGGCGGCCGAGTTCAGTGCATGAA240
KPNADLSHLPSNGGRVQCMK
GGTACGCACGTACAAGGCTCGTGGCTCGAGTCGGAAACCTCTGTTACCGAGATAGTCGTT300
ACGAATCATATACTGTGGATGTAATTCTTATGACAGGTGTGGCCGATCGAGGGCTTGAAG360
VWPIEGLK
AAGTTTGAGACCCTGTCCTACCTTCCGACACTGAAGGACGAGGCGTTGCTGAAGCAGATC420
KFETLSYLPTLKDEALLKQI
GAGTACCTTCTCCGCTCCAAATGGATTCCCTGCTTGGAGTTCTGCCCCGTAAGTAACTTC480
EYLLRSKWIPCLEFCP
ACCTGCCCCATGGTGGGCATCCAGTAACCTTGATATCCAGCATGCATAACGGGGATTGAA540
GTCGATCGTAATGACCATAACAGAAAGGGTTCGTGTGGCGCGAGAACCACCGGTCGCCGG600
KGFVWRENHRSP
GGTACTACGACGGGCGGTACTGGACCATGTGGAAGCTGCCCATGTTCGGGTGCACCGACG660
GYYDGRYWTMWKLPMFGCTD
CTGTGCAGGTGGCGAAGGAGGTGGAGGAGTGCAAGAAGGAGTACCCCCACGCCTTCATCC720
AVQVAKEVEECKKEYPHAFI
GCATCATCGGCTTCGACAACAACCGCCAGGTGCAGTGCATCAGTTTCATCGCCTACAAGC780
RIIGFDNNRQVQCISFIAYK
CGACCGGCTACTAGACGATTCGGATCCGGCTCTTCGGATTGCTTTCTTTGGTTCAGTGTT840
PTGY
GGATGTTTCCCCTTCTCTCGTTGTCTCCTCTACGCAACCGCCGACAGTGCAGCAGCGCAC900
TGAGGCCGTCTATGTTTTGTTTCCCCAAGAACGCGGAGCTTGTATGTTAAAAAGTTTATT960
ATGGACGTTCGCTTATTTATAATAAAGGCTACCCAATGTAACGAAAAAAAAAAAAAA1017
图4香蕉rbcS-mc的基因组DNA序列
内含子末端保守的剪切位点GT和AG加黑并下画线，起始和终止密码子下画线
Fig4SequenceoftherbcS-mcgene，theconservedsplicesitesGTandAGattheendofintronsareinboldandunderlined；theinitialandstopcodonsareunderlined
2.5香蕉1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基核苷酸序列的同源性分析
用NCBI的BLAST软件进行核苷酸序列同源性比对，结果显示在NCBI核酸数据库中，与rbcs-mc有同源性的rbcS家族基因或类似基因共有164条，这些基因来自小果野蕉（Musaacuminata）、拟南芥（Arabidopsis）；油菜（BrassicanapusL）；马铃薯（Solanumtuberosum）；番茄（Lycopersiconesculentum）；普通烟草（Nicotianatabacum）；黄瓜（Cucumissativus）；莴苣（Lactucasativa）；亚麻（Linumusitatissimum）、毛竹（Phyllostachysedulis）、普通野生稻（Oryzarufipogon）、水稻（Oryzasativa）、燕麦（Avena）、白桦（Betulapendula）等十几个不同的物种。 2/4 首页 上一页 1 2 3 4 下一页 尾页 |
