论文摘要：核桃黑斑病是危害核桃生产的重要细菌病害，造成树势衰弱，减产严重，甚至树体死亡。2008年在北京郊区栽植的幼树上发现疑似病害，且呈爆发之势。本研究对其病原进行了分离、致病性测定和16SrDNA序列测定分析。用组织分离法分离核桃黑斑病菌，纯化培养后用针刺接种法回接到健康核桃树枝条和叶片上，14天后叶片和枝条分别出现典型病斑。以分离的核桃黑斑病菌的总DNA为模板，采用细茵16S rDNA的通用引物，通过PCR扩增到约1.5Kb的片段，克隆到pMD-18T载体。经测序表明克隆的16S rDNA片段长为1453核苷酸，通过GenBank上BLAST分析，表明该病原细菌为Xanthomonas campestris,,其致病型正在分析中。
论文关键词：核桃黑腐病,细菌,致病变种
核桃黑斑病，又名核桃黑腐病，在欧美一些国家有发生。在我国，该病广泛分布于河北、山东、山西、辽宁、河南、江苏、浙江、四川、云南、山西、甘肃等核桃产区。据对河南安阳等地调查，一般植株受害率达70％～9o0％，果实受害率10％～40％，严重时达65％以上据山西调查，一般被害株率60％～100％，果实被害率30％～70％，重者90％以上，核仁减产可达40％～50[海1]％。甘肃省主要分布在兰州、天水、临夏等地，病果率80%以上。核桃黑斑病主要危害叶片、嫩枝、幼果及花器，在叶片上出现圆形及多角形小褐斑，严重时相连成片，病斑外围有水渍状晕圈；枝梢上病斑长形，黑褐色，稍凹陷，严重时因病斑扩展包围枝条而使上段枯死；花序受侵后，产生黑褐色水渍状病斑；幼果受害时，果面发生黑色小斑点，无明显边缘，逐渐扩大成片变黑，并深入果肉，使整个果实连同核仁全部变黑腐烂脱落。核桃发病后造成幼果腐烂，早期落果，不脱落的被害果，核仁出油率低，对产量影响大。此外，核桃黑斑病除危害核桃外，还能侵染许多核桃属植物。
补充国外有关此病研究进展。国外关于此病害的研究也不多，我以前给你的资料基本比较全，概括几句话。另外可在google和CABI中检索看是否有新的文献。该病主要危害幼果和叶片，也可危害嫩枝及花器，病害发生时首先在叶脉处出现圆形及多角形的小褐斑，严重时相连成片，病斑外围有以水渍状晕圈，中央灰褐色部分有时脱落，形成穿孔。枝梢上病斑长形，褐色，稍凹陷，严重时因病斑扩展包围枝条而使上段枯死。幼果受害时，果面发生黑色小斑点，无明显边缘，以后逐渐扩大成片变黑，并深入果肉，使整个果实连同核仁全部变黑腐烂脱落。花序受侵后，产生黑褐色水渍状病斑[4,9,10]。主要是病菌鉴定、分类和病害流行规律研究。国外有关关于核桃黑斑病病原菌的分类，目前普遍认可的是的研究，主要是病原物的鉴定，病害的发生规律及其防治。其病原物鉴定为Xanthomonasarboricolapv.Juglandis，该病原菌在休眠芽上越冬，春季侵染芽，靠昆虫、花粉和雨水传播，,土壤条件和栽培管理是该病害发生的主要因素。该病原物在休眠芽上越冬，春季侵染芽，靠昆虫、花粉和雨水传播[从周老师您给我的那篇英文文献中获得，我找不到原文，作者和出版事项不知]。混有代森锰、代森锰锌或代森锌的铜制剂作为杀菌剂，在芽大量发生而叶片刚展开时进行第一次喷药，对该病害具有最好的防效。Soltani等人用16个不同基因型的核桃与该病原物进行抗病性对比实验，找出了最抗病的基因型94和最感病的基因型69。
细菌16SrRNA基因在漫长的进化中具有高度的保守性而且其长度适中（约l500个核苷酸），便于测序，因而近十年来细菌分类学家广泛采用16SrDNA序列分析法进行细菌的遗传特性、分子差异、发育进化和分类学研究。通常将某一未知细菌的16SrDNA序列与GenBank中的已提交的16SrDNA序列进行同源性比较，便可初步确定该细菌的种属地位，某些细菌甚至可以鉴定到种的水平。当前普遍的观点认为：l6SrDNA序列同源性小于98％，则可认为属于不同的种；16SrDNA序列同源性小于93％～95％，则可认为属于不同属。
2008年在北京市郊区县进行果树病害调查时，发现核桃幼树上发生核桃黑斑病疑似病害，在幼嫩枝条、叶片、幼果以及主干上均发现病斑，病株率高达40%，且呈爆发之势。为鉴定该病的病原菌，以便进行有效防治和控制蔓延，本研究对其病原进行了分离、致病性测定和16SrDNA序列分析，初步确定了病原菌分类地位。
1材料与方法
1.1植物材料
采集表现典型黑斑病症状的当年生幼嫩枝条，分别放在自封袋中带回实验室，直接分离病原菌或冰箱冷藏保存。
3年生健康核桃树，用于回接实验，进行致病性测定。
1.2试剂
TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×Taqbuffer、氨苄青霉素、DNAMarker、PCR产物回收试剂盒购于北京奥赛博生物技术公司；DNA提取试剂盒购自中科瑞泰生物技术公司；PCR克隆载体为pMD-18T，购自大连宝生物公司。
1.3菌株的分离、保存与致病性测定
用组织分离法分离病原菌。取表现典型症状的幼嫩枝条表面消毒后去掉表皮，将病斑部位的木质部组织[海2]在灭菌研钵中捣碎，加入灭菌水混匀，在LB平板上划线分离，28℃下培养。参照核桃黑斑病菌菌落生长形态及颜色[海3]，进行分离纯化，所得菌株保存在LB平板和试管斜面培养基上，4℃冰箱保存。
致病性测定采用针刺法接种。将保存的菌种划线接种于LB平板上，28℃活化培养，然后挑取单菌落在液体LB培养基中扩大培养，配制10cfu/mL菌体悬浮液，分别接种健康核桃枝条和叶片。从植株顶芽下的第3张完全展开叶片的叶腋处用一次性无菌注射针刺到幼嫩枝条上，抽出注射针后滴上一滴浓度为10cfu/mL的细菌悬浮液，用脱脂棉包住伤口，以灭菌水为对照，每处理5次重复。 1/4 1 2 3 4 下一页 尾页 |
