论文摘要：为了建立苹果砧木“中砧1号”的茎尖离体保存技术，本实验以M9和富士为对照，研究了培养基中添加不同浓度蔗糖或生长抑制剂对试管苗生长速率的影响以及包埋干燥法和玻璃化法预处理对试管苗茎尖超低温保存效果的影响。结果显示：不添加生长抑制剂，蔗糖浓度为20g·L 时，中砧1号试管苗离体保存效果比较好。常规培养基（蔗糖浓度30g·L ）中添加5mg·L 的CCC、0.1mg·L 的ABA或60mg·L 的B9，也可以达到相同的效果。用包埋干燥法和PVS3玻璃化液预处理，中砧1号超低温保存后的茎尖再生率较高。
论文关键词：苹果,砧木,离体保存,超低温保存
中砧1号(Zhongzhen1)是本实验室历时25年从小金海棠(MalusxiaojinensisChengetJiang)中选育出的耐缺铁黄化苹果砧木新品种，其亲本小金海棠是四倍体(2n=4x=68)野生种质资源，具有耐盐碱、耐热、耐旱、耐涝、抗寒（-45℃）、抗白粉病等特性。中砧1号与富士、金冠、国光等苹果主栽品种的嫁接亲和性好，具有较强的无融合生殖特性，去雄套
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★通讯作者：韩振海(1963-)，男，中国农业大学教授，博士生导师。E-mail:rschan@cau.edu.cn
袋后花朵坐果率为86.7%，实生苗整齐一致。但中砧1号果实结籽率较低，平均每果饱满
种子数仅0.9粒，约需200kg果实出1kg种子。由于无融合生殖率未能达到100%，种子
产量低两方面原因，目前中砧1号在生产上尚不能实现实生繁殖。
采用茎尖分生组织培养技术快速繁殖的中砧1号苗木具有质量好，繁殖速度快，避免病毒侵染等优点。但实践中存在两方面问题，一是多代继代繁殖易引起遗传变异和表遗传变异的积累；二是每次重新取材新建试管无性系的周期较长。为避免上述问题，目前常采用试管苗低温和超低温保存两条途径，前者适用于中短期保存，后者适用于长期保存。
通过调节培养条件，抑制保存材料的生长、减少营养消耗来实现延长继代培养时间是植物种质离体保存的重要方法之一。具体途径有低温、高渗透压、加生长抑制剂、降低氧分压、调整培养基中营养的浓度等。蔗糖不易被外植体吸收，高浓度蔗糖提高了培养基的渗透势负值，造成水分逆境，从而降低细胞膨压，使细胞吸水困难，减弱新陈代谢，生长减缓。另外，常用的的生长抑制剂有矮壮素(CCC)、脱落酸（ABA）、多效唑（PP333）、甲基丁二酸（MSA）、缩节胺（pix）等。
玻璃化法和包埋干燥法是果树作物超低温保存常用的处理方法。包埋干燥法保存苹果品种的离体茎尖可以获得较高的存活率。玻璃化的关键在于玻璃化液及材料在玻璃化保护剂中的脱水时间。玻璃化液的种类有PVS1（15%二甲基亚砜+22%甘油+13%聚乙二醇+13%乙二醇）、PVS2（30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖）、PVS3（50%甘油+50%蔗糖）、PVS4（30%甘油+10%二甲基亚砜+25%聚乙二醇）和PVS5（15%甘油+15%甘露醇+13%二甲基亚砜+15%甘露醇+15%乙二醇）等。由于冰冻保护剂对植物组织有一定的毒害作用，所以冰冻保护剂的选择、成分配比及处理时间需要进行严格的筛选试验，以其达到最高成活率。
同属不同种的材料离体保存成活率有差异，影响植物材料离体保存的因素很多，不同植物，同一植物不同类型的材料，其保存的难易不同。目前中砧1号尚未建立低温、超低温保存技术体系。本试验主要通过缓慢生长法和超低温保存法对中砧1号进行离体保存，建立低温和超低温保存方法。
1材料和方法
1.1试验材料
中砧1号（Zhongzhen1）、M9、富士（Fuji）
中砧1号扩繁培养基为MS+BA0.5mg·L+IBA0.5mg·L；M9扩繁培养基为MS+BA
0.6mg·L+IBA0.3mg·L；富士扩繁培养基为MS+BA1.0mg·L+NAA0.05mg·L；其中蔗糖30g·L，琼脂7g·L。培养温度为23±2℃，光照2000lx，光照时间为14h·d。
1.2试验方法
1.2.1低温保存
蔗糖处理：将待保存培养苗接种在分别加入20、30（ck）、40、60、80g/l不同浓度蔗糖的MS培养基的试管中。
CCC处理：将待保存培养苗接种在分别加入0（ck）、5、15、25、35mg/l不同浓度CCC的常规MS培养基的试管中。
ABA处理：将待保存培养苗接种在分别加入0（ck）、0.1、0.4、0.7、1.0mg/l不同浓度ABA的常规MS培养基的试管中。
B9处理：将待保存茎段培养苗接种在分别加入0（ck）、60、80、100、120mg/l不同浓度B9的常规MS培养基的试管中。
将待保存培养苗分别接种在含有上述物质的MS培养基中，每个试管接种1株，5次重复，接种后的试管用牛皮纸封口，放在光强2000lx，温度23±2℃，光照时间14h·d培养10天后，转到光照500lx、温度为4±2℃、全天光照下进行培养。4个月以后，用直尺测量植株高度，计算得出植株生长率（生长率=（最终植株高度-原初植株高度）/原初植株高度），使用Excel和SPSS数据分析软件对实验数据进行分析。
1.2.2超低温保存
继代培养60d以上的材料置于4℃预培养驯化1个月，剥茎尖分别进行包埋干燥法和玻璃化法预处理。
包埋干燥法：将茎尖置于MS+0.3mol·l蔗糖的固体培养基4℃预培养1d，用滴管吸取含一个茎尖的液体转移至100mmol·lCaCl及0.1、0.3、0.5mol·l蔗糖的培养液中分别包埋2、3、4、5h，无菌空气干燥，装2.0ml冷冻管，每管装10个茎尖，迅速投入液氮。 1/3 1 2 3 下一页 尾页 |
