论文导读:：苹果表皮的某些蜡质成分的形成。苯胺兰染色技术在更为广泛的领域展现了新的应用潜力。果实表皮病害的电镜分析。本研究利用扫描电镜。
论文关键词：苹果，苯胺兰染色，表皮病害，扫描电镜
果皮作为直接与外界接触的组织，起到了保护果实的第一道屏障的作用。其表皮和蜡质层的发育形态和结构，将直接影响到其保护效果[1]。Cajuste 等[2]在柑橘上的研究发现，柑橘表皮蜡形态的重新分布，可能参与了乙烯诱导的非冷害性果皮pitting，而在乙烯诱导下产生的新的蜡质，则可能参与了覆盖果实表面的皮孔、裂缝，或者缺乏蜡质层的区域，改善了柑橘对青霉和绿霉病的物理防护作用。Curry 等[3]的研究结果表明，苹果表皮的某些蜡质成分的形成，促进了果实greasiness disorder的发生，并发现1-甲基环丙烯可延迟这些蜡质成分的形成，从而降低果实贮藏末期greasiness disorder的发生。Veraverbeke等利用苹果表皮的超微结构，提出了水分损失的数学模型杂志铺，并用此模型模拟了不同品种苹果在贮藏环境中的失水过程[4,5]。国内涂俊凡[6]曾对易患病和不易患病的柑橘品种表皮细胞进行了比较，发现易患病的柑橘果实表皮油胞距离大，黄皮层厚。屈红霞等[7]对黄皮的研究表明，大鸡心黄皮果皮薄，气孔开口大，可能是造成大鸡心黄皮不如小鸡心和圆种黄皮耐贮藏的原因。龙眼表皮的形态结构，也决定了不耐贮藏的缺点[8]。对枇杷、龙眼等几种不耐贮藏的热带水果果实表皮的研究结果也表明，果实表皮的角质层厚度、表皮细胞的排列方式、完整性等，都对果实的耐贮性、失水褐变等有重要影响[9,10]。陶世蓉[11]、李治梅[12]等在几种梨上的研究发现，角质膜和表皮细胞厚的梨果实耐贮藏。对多个品种和不同生态区苹果组织结构的电镜分析发现，果皮厚、细胞层数多的果实耐贮性好[13,14,15]。
这些结果表明，果实表皮细胞及蜡质层的结构和发育状况，影响果实耐贮性和贮藏后期表皮相关病害的发生，是果实表皮相关病害发生的共同结构基础。研究表皮结构对于揭示表皮相关病害的发病机理，具有重要的意义。尽管如此，由于表皮结构形态判别多依赖于昂贵的电镜设备和复杂的前处理技术，在实际生产中很少有研究涉及到以表皮蜡质层结构的形态和组成作为预测果实质量的指标。
苯胺兰(C32H25N3Na2O9S3)是一种酸性染料，能与细胞浆等碱性成分、蛋白质等结合，常用于动植物组织染色、制片技术中。近年来，随着科学研究的深入，苯胺兰染色技术在更为广泛的领域展现了新的应用潜力。在植物中，用苯胺兰染色可评价茄子[16]、草莓[17]花粉的活力，判断高粱花粉的萌发和花粉管的伸长[18]，观察植物细胞壁胼胝质的合成和沉积[19]；在环境科学中，用于区分水体的中有生命力浮游生物和死亡的浮游生物[20]；在动物中，用于评价小鼠[21]、鸡[22] 的精液质量等。Jedrzejczak等[23] 已用苯胺兰染色作为精液繁殖能力的指标之一，实现了对精液繁殖能力的精确预测，并建立了多元回归数学模型。但在果实采后领域中，尚未见相关报到。
我们前期的研究表明杂志铺，富士苹果的染色指数与果实贮藏末期几种表皮病害如二氧化碳伤害、好果率，以及腐烂等有一定的关系，但对其中相关性的机理仍然有待于进一步的研究。本研究利用扫描电镜，研究了染色部位和病害部位的形态与结构，目的为阐明苯胺兰染色预测苹果冷藏末期表皮病害的结构机理。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
实验用红富士苹果（Malus domestica Borkh cv. Fuji）于2009年10月17日（本年度的商业采收期内）采自山东省招远市蚕庄镇一典型果园。果实均为套双层纸袋果，在采摘前15 d统一摘除果袋。果实采摘后选择直径在85 mm左右的大小均一、无病虫害、无机械伤、着色良好的果实当天运至实验室进行处理。
果实运至实验室后，每个果实均用干净、流动的冷水冲洗苹果60秒，放入真空干燥器中，加入0.2%的苯胺蓝溶液，确保所有苹果都浸没在苯胺蓝溶液中，启动真空泵，使真空度达33 MPa，然后关闭真空泵，在该真空度下保持60 秒。打开阀门，使苹果继续在溶液中浸泡60 秒，然后取出，用干净、流动的冷水冲洗干净。冲洗后的苹果放在托盘中晾干30 min，2小时或第二天观察结果，统计染色指数。染色指数分级标准如下：果实表面无染色为0级，染色面积占果实总面积＜10%为Ⅰ级，10%－20%为Ⅱ级，20%－40%为Ⅲ级，＞40%为Ⅳ级，染色指数计算公式为：染色指数（％）＝Σ（每级果数×对应级数）×100/（总果数×最高级数）。每个产地果实染色均重复三次，每重复果实250-270个苹果（大约60 kg）。果实染色处理后，从染上色的果实和未染上色的果实中各选6个，进行电镜分析，电镜分析方法见1.3。
1.2 贮藏
果实处理完后用普通聚乙烯保鲜袋（0.02mm×65cm×65cm）包装，然后放入纸箱中在0±1℃杂志铺，相对湿度（RH）85-90％的冷库中贮藏7个月，取出后根据果实病害情况进行电镜分析。
1.3 果实表皮病害的电镜分析
分别将6个正常果实表皮和发生虎皮病、二氧化碳伤害、腐烂的果实表皮病害部位取样，在扫描电镜下分析正常果实表皮和发生病害表皮差异。电镜分析方法如下：取0.8×0.3cm大小的待检部位果实表皮，用刀片小心刮去果肉，然后用2.5%的戊二醛固定12-24小时，经0.1mol/L、pH7.0磷酸缓冲液清洗2小时以上，中间换2-3次新液；再用1%的锇酸固定1-1.5小时，用双蒸水清洗2小时，中间换2-3次新液；用上升浓度的酒精脱水（50%、70%、80%、90%、100%两次），每级脱水20分钟；然后用100％醋酸异戊酯置换30 min，用HCP-2型临界干燥仪干燥，粘托后用IB-5粒子溅射仪镀铂，日立S-570扫描电镜观察和拍照。样品电镜分析重复6次，选取有代表性电镜照片进行分析。
2 结果与讨论
2.1 苹果苯胺兰染色的特点及其染色结构机理
图1 苯胺兰染色处理后果实染色情况（A未染上色的果实；B:点状染色的果实；C：片状染色的果实）
Fig. 1 Apple fruit after treatment byaniline blue staining pre-storage.
(A: fruit without being stained; B:fruit with spot-staining; C: fruit with slice-staining)
图1A是经过苯胺兰染色后未染上色（染色为0级）的苹果果实，可见染色为0级的果实光滑完好。图1B是发生点状染色的果实，染色部位主要是以皮孔为中心，向周围扩散。染色处皮孔一般较大，且比较明显，果面多数部位没有被染色。图1C是染色比较重的果实，整个果面有连成一片或几片的面积都被染色。在该成片染色的果实表面可以发现有较多的白色皮孔。一般认为，果皮表面较大的白色斑点与果实发育中早期的干旱有关。后期的电镜分析表明，成片染色除与皮孔发育不良有关外，还与果面蜡质层的分布和结构有关（图2）。
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