阿拉伯半乳糖蛋白对香蕉悬浮细胞胚性状态的影响_小论文

论文导读:：采用火箭琼脂糖凝胶电泳法测定了培养15 d后的香蕉悬浮细胞液体培养基中的阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan-proteins, AGPs）的含量，发现具有体胚发生能力的贡蕉、大蕉和龙牙蕉‘过山香’品种的胚性悬浮细胞（embryogenicsuspension cells, ECS）培养基中的AGPs含量分别达到36、48、56 μg/mL，而在不能进行体胚诱导的香芽蕉‘威廉斯’品种的非胚性悬浮细胞（non-embryogenicsuspension cells, NECS）的培养基中检测不到AGPs，说明悬浮细胞分泌到培养基中的AGPs含量与香蕉悬浮细胞的胚性状态有一定的关系。在香蕉ECS的悬浮培养过程中，添加不同浓度的?GlcY试剂 （?-glucosyl Yariv 试剂, 一种能与AGPs特异性结合并引起AGPs沉淀的人工合成化学物质） 到悬浮培养基中可引起胚性细胞与非胚性细胞 （ECS/NECS） 的比值下降；在香蕉的ECS体胚诱导过程中，添加不同浓度?GlcY试剂到体胚诱导培养基中，引起体胚发生频率下降。这些结果表明，AGPs在香蕉悬浮细胞的胚性保持过程中起到重要的作用，并且具有剂量效应。
论文关键词：阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)，香蕉，悬浮细胞

 

香蕉离体细胞胚性的恢复和保持是决定其再生能力的关键，也是香蕉生物技术育种的重要前提。但是，胚性反应低、周期长、胚性易丢失等问题一直制约着香蕉高效胚性悬浮细胞再生体系的建立及其在生物技术育种中的应用。因此，如何有效地促使香蕉离体细胞胚性的恢复并有效地保持，成为香蕉生物技术发展的核心问题。

AGPs（Arabinogalactan-proteins，阿拉伯半乳糖蛋白）具有细胞间信号的作用。研究表明小论文，从不同植物中分离获得的AGPs对于细胞的胚性恢复具有相似的生理功能。Letarte 等发现采用阿拉伯胶可以代替看护培养（共培养）促进小麦（Triticum aestivum L.）小孢子母细胞发育成完整的植物^[1]；Egertsdoter 和 Von Aronld从挪威云杉（Picea abies）种子中提取的AGPs可以促进挪威云杉悬浮细胞的体胚发育^[2]。从胡萝卜（Daucuscarota）种子中分离的AGPs可以促进胡萝卜悬浮细胞的体胚发生^[3,4]。Kreuger 等研究发现从胡萝卜种子中获得的AGPs可以促进仙客来（Cyclamen persicum）在培养过程中胚性细胞团的增加，认为AGPs的活性没有品种特异性^[5]。这些实验都表明，从不同的植物材料获得的AGPs具有促进其它植物体胚发生的能力，AGPs在很多植物细胞胚性的保持上具有重要的作用。李佳等的研究发现大蕉（Musa paradisiaca Linn. cv. Da JiaoABB）的非胚性悬浮细胞与贡蕉[Musa acuminata cv. Mas （AA）]的胚性悬浮细胞悬浮培养液的AGPs含量差别很大^[6]。

?GlcY-试剂是一种与AGPs特异性结合的化学试剂，具有生物活性，在进行AGPs功能的研究时通常采用添加?GlcY-试剂的方法进行。在菊芋（Cichorium）胚性悬浮细胞的研究中，发现添加?GlcY-试剂会导致菊芋悬浮细胞的胚性丧失^[7]。本文对具有胚性和不具备胚性的香蕉悬浮细胞的液体培养基中的AGPs含量进行了测定，并通过对胚性悬浮细胞的培养基中添加?GlcY-试剂的方法，研究AGPs在香蕉胚性的保持上所起的作用。

1材料与方法

1.1 材料

贡蕉[Musa acuminata cv. Mas （AA）]，龙牙蕉‘过山香’品种（Musa AAB Silk cv. ‘Guoshanxiang’），大蕉[Musa paradisiaca Linn. cv. Da Jiao（ABB）]，香芽蕉‘威廉斯’品种（Musa AAA cv. Williams）的未成熟雄花序小论文，取自广东省农业科学院果树研究所建立的“国家果树种质-广州荔枝香蕉圃”。

参照魏岳荣等 ^[8]、李哲等 ^[9] 的方法，以贡蕉、大蕉、香芽蕉‘威廉斯’的未成熟雄花为外植体建立均质的细胞悬浮系。龙牙蕉‘过山香’的胚性细胞悬浮系（ECS）的建立参照魏岳荣等的方法进行^[10]。细胞悬浮系保持在M2液体培养基^[11]中。悬浮培养保持在持续110 rpm 的旋转摇床，28±1 ℃、黑暗条件下进行。

1.2香蕉悬浮细胞体胚发生能力的检验

将悬浮细胞直接接种到M3培养基^[11]，计算体胚发生频率作为衡量悬浮细胞胚性的标准。诱导体细胞胚的发生M3培养基组成为：SH培养基^[12]中的大量元素和微量元素及其铁盐+ MS维生素^[13]+ 4.5 μmol/L 生物素 + 680μmol/L 谷氨酰胺+ 2 μmol/L脯氨酸 + 100mg/L 麦芽水解物 + 1.1 μmol/L NAA + 0.2 μmol/L 玉米素 + 0.5 μmol/L 激动素 + 0.7μmol/L 2-二甲基丙烯嘌呤+ 29 mmol/L 乳糖 + 130mmol/L 蔗糖 + 2 g/L Gelrite。具体方法参照魏岳荣的方法进行^[8],体胚诱导频率=体胚总数/ml PCV ECS。

1.3 香蕉悬浮细胞培养液中的AGPs的含量测定

?GlcY-试剂的制备参照Yariv等的方法^[14]进行；悬浮细胞液体培养基中的AGPs浓度通过火箭琼脂糖免疫电泳方法进行测定^[15]。

1.4 ?GlcY-试剂对香蕉悬浮细胞生长状态和体胚发生能力的影响

将?GlcY-试剂按0、5、10、20、40 、60 μM的浓度加入到M2液体悬浮培养基中，龙牙蕉‘过山香’胚性悬浮细胞按照1.5%浓度分别接种到上述含有不同浓度?GlcY-试剂的培养基中。15 d后计算悬浮细胞的PCV（packed cell volume，细胞密实体积），并在显微镜视野下统计胚性和非胚性细胞（ECS/NECS）的比例。

将?GlcY-试剂按照下列浓度加入到M3培养基中: 0、5、10、20、40 μM、60 μM，将接种继代7-10 d的大颗粒龙牙蕉‘过山香’品种品种悬浮细胞用于进行体胚诱导，30 d后统计体胚发生率和细胞总体积，体胚诱导频率=体胚总数/ml PCV ECS。

2结果与分析

2.1不同基因型香蕉悬浮细胞培养液中的AGPs的含量与体胚发生的关系

表1不同基因型香蕉悬浮细胞的体胚发生能力与培养基中AGPs含量测定

Table 1 Quantification of thefrequency of somatic embryogenesis and AGPs content in liquid medium of cellsuspensions of different genotype of banana

表中数据是三个重复实验的平均值 ± 标准误Data represent average ± S.E. of three replicates.

从对各种香蕉悬浮细胞进行体胚诱导的结果显示（表1），龙牙蕉‘过山香’、贡蕉、大蕉的体胚发生能力较强，相应的悬浮培养液中的AGPs含量较高；香芽蕉‘威廉斯’的悬浮细胞基本没有体胚再生能力小论文，悬浮细胞培养液中也检测不到的AGPs的存在。因此，悬浮培养液中的AGPs存在可作为检测香蕉悬浮细胞胚性状态的一个潜在指标。

2.2 ?GlcY-试剂对龙牙蕉‘过山香’胚性悬浮细胞生长状态和体胚发生能力的影响

图1 ?GlcY试剂对龙牙蕉‘过山香’悬浮细胞状态的影响

a对照胚性悬浮细胞，bar = 50 μm。b用40 μM ?GlcY试剂处理后的胚性悬浮细胞

Fig. 1-14 Effects of ?GlcY reagenton cell suspension of cv. Guoshanxiang (AAB)

a Embryogenic cellsuspension, bar = 50 μm. b Embryogenic cell suspension treated with 40 μM?GlcY, bar = 50 μm.

表2 ?GlcY-试剂对龙牙蕉‘过山香’胚性悬浮细胞生长、细胞状态和体胚发生的影响

Table 2 Effects of ?GlcY on growth of ECS, cell statusand somatic embryogenesis of cv. Guoshanxiang （AAB)

实验结果显示，在龙牙蕉‘过山香’的胚性悬浮细胞培养基中添加各种浓度的?GlcY-试剂后，经过15 d的培养，细胞增殖量无显著的变化，也就是说，添加?GlcY-试剂不影响细胞的分裂和生长（表2）。但是显微镜观察发现，与对照胚性悬浮细胞相比（图1-a），经过?GlcY-试剂处理后，具有胚性特征的细胞及细胞团数量显著下降（图1-b，表2）小论文，绝大多数的细胞转变为长条形，内含物含量降低的典型的非胚性细胞状态，这些细胞不具备体胚发生能力，说明添加?GlcY-试剂使细胞状态从胚性状态转变为非胚性状态。

在M3培养基中添加各种浓度的?GlcY后，发现龙牙蕉‘过山香’品种细胞团在M3培养基上继续增殖，30 d后，各种处理的细胞总体积无明显的差异。但是，经过45d的培养，悬浮细胞的体胚发生频率随着?GlcY-试剂浓度的增高而显著下降。当?GlcY-试剂浓度达到60 μM时，体胚发生频率已经非常低。结果表明，?GlcY对’过山香’香蕉胚性细胞的分裂和增长无显著影响，但抑制细胞体胚发生能力小论文，且具有剂量效应。

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