ISSR标记在中国野生葡萄分类中的应用

论文导读:：利用ISSR标记对包含16个中国葡萄野生种及其近缘植物的81份材料进行分类研究，从100条引物中筛选出13条带型清晰、重复性高、多态性好的引物用于ISSR扩增，共扩增出分子量在300～2000bp之间的185条带，其中多态性条带175条，多态百分率为94.6%。根据ISSR扩增结果，利用NTSYSpc2.10e软件进行相似性系数分析，81份葡萄种质的遗传相似性系数为0.57～0.99。通过UPGMA进行聚类分析，在遗传相似系数为0.83处，79份真葡萄亚属材料聚成22类，聚类结果与传统的分类结果基本一致。同时，根据ISSR聚类结果，将供试材料‘毛葡萄1099’确定为桑叶葡萄，对‘燕山葡萄0947’是否为燕山葡萄提出质疑，并检测出供试的变叶葡萄材料不是一个纯种，而是存在种间的过渡类型。
论文关键词：

 

我国是葡萄属植物的重要原产地之一，也是世界葡萄属植物种质资源最丰富的国家，原产的葡萄属植物有38个种、1个亚种和7个变种^[1]，此外，尚不确定或有争议的疑问种或变种14个^[2]。不同研究者从形态学^[3-7]、孢粉学^[8-10]、解剖学^[11]和生物化学^[12-15]等方面对中国野生葡萄的分类进行了大量的研究，利用RAPD技术在葡萄属植物和葡萄品种的分类及亲缘关系上也有一些探索^[16,17]。由于葡萄属内种间性状的过渡类型和种内多型性现象比较常见，加之分类学者对种或变种等的分类标准意见不一，使得我国原生的葡萄属植物种类的具体数目尚无公认的定论^[2,18,19]。因此，可以利用分子生物学方法对其进行更为深入的研究。ISSR（InterSimple Sequence Repeat）标记是基于微卫星序列发展起来的一项技术^[20]，与RAPD、RFLP、AFLP、SSR等分子标记方法相比，该方法具有快捷、稳定、成本低、DNA用量少和安全性较高等优势^[21]，已在果树遗传学研究各个方面得到广泛应用，如品种鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性分析以及遗传图谱的构建等^[22-26]。

本研究应用ISSR分子标记技术，对包括东亚种群（16个中国野生葡萄种）、欧亚种、欧山杂种、美洲种群（沙地葡萄和河岸葡萄）和砧木品种华佳8号（华东葡萄×欧亚种）及其近缘植物在内的81份葡萄种质进行研究，旨在探索利用ISSR标记在葡萄属植物分类上的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

材料来源于中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质葡萄资源圃，其名称和编号见表1。

表1 用于ISSR分析的葡萄材料

Vitis materials used for ISSRanalysis
 

table1

1.2 试验方法

采用CTAB法从葡萄嫩叶中提取基因组DNA^[27]，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，使用Eppendorf公司生产的Bio-Photometer plus核酸定量仪检测基因组DNA的浓度和纯度，并将浓度稀释至30～50ng/μL。ISSR引物参照文献^[21]，由上海生工合成。参照吴子龙和Moreno等的试验方法，对ISSR-PCR扩增体系进行优化^[28,29]。在20μL的扩增体系中：Mg²⁺为2.5mmol·L^-1，dNTPs为0.25mmol·L^-1，引物为0.5μmol·L^-1，Taq DNA聚合酶为2U，模板用量在30～50ng之间。PCR扩增程序：94℃预变性5min，(94℃变性30sec，51.4～58.6℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环)，72℃延伸10min，4℃保存。

PCR反应在德国Biometra公司的T-professional G型PCR仪上进行。扩增产物在含0.5μg/ml EB的TAE缓冲液中进行电泳，使用美国UVP公司的LMS-26E凝胶成像仪进行拍照。ISSR-PCR反应中所使用的dNTPs、MgCl₂、Taq DNA聚合酶，均购置于TaKaRa公司。

1.3 数据统计分析

根据每条引物扩增产物在琼脂糖凝胶中迁移率的不同，对电泳结果进行统计，扩增阳性（有条带出现）赋值为1，扩增阴性（无条带出现）赋值为0，依据条带有无统计得到所有位点的二元矩阵，利用NTSYSpc2.10e软件进行相似性系数分析，并通过非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物筛选

本试验以毛葡萄、山葡萄和变叶葡萄为模板，对加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供的100条引物序列进行初筛^[21]，筛选出条带较为清晰、多态性较高的66条引物。并对66条引物进行退火温度的筛选（图1），得到13条带型清晰、重复性高、多态性好的引物（表2）。结果表明，在ISSR-PCR扩增中利用样本差异进行引物初筛，并通过退火温度对初筛引物进行复筛可以快速有效的获得较为理想引物。

图1 引物UBC810对毛葡萄最佳退火温度的筛选

温度45℃~65℃；M 100bp DNA Ladder

Fig. 1 ISSR-PCRprofiles of V. quinquangularis Rhed. Using UBC810 primer

Temperature varyfrom 45℃ to 65℃；M 100bp DNA Ladder

表2 不同引物的碱基序列及扩增结果

Sequence and amplification efficiency
 

table22.2 ISSR多态性分析

经过初筛和复筛，得到13条引物用于ISSR-PCR反应（表2），图2为引物UBC807的部分扩增结果。由表2可知，13条引物共扩增出185个位点，其中多态性位点为175个，占94.6%。不同引物扩增结果各不相同，多态性位点最多的是UBC812、UBC835和UBC890，为18个；位点数最少是UBC855，为7个，平均多态性位点数13.5个。其中，多态百分率最高的是UBC807、UBC810、UBC812、UBC818、UBC827、UBC836、UBC855和UBC890，为100%，最低的是UBC835，为78%。可见，ISSR在葡萄属植物植物中多态性位点较多，其中所包含的大量多态性信息可用于葡萄属植物的分类研究。

图2 引物UBC807对部分葡萄材料的扩增结果

M 100bp DNA Ladder;样品泳道顺序同表1

Fig. 2 Amplified results using primer U807 for somevitis materials

M. 100bp DNALadder; The number of samples is the same as in Table 1

2.3 聚类分析

81份葡萄材料的遗传相似系数为0.57～0.99，以蛇葡萄(A sinica (Miq. ) W. T. Wang.)和葡萄属圆叶葡萄亚属的‘Dixie’为外类群，与真葡萄亚属的遗传相似系数分别为0.57和0.60。在遗传相似系数为0.70处，真葡萄亚属的东亚种群、欧亚种和美洲种群聚为一大类（图3）。在形态上，毛葡萄和腺枝葡萄最为近似，仅存在腺毛有无的差别，遗传相似性系数分析显示其种间遗传相似度最大（0.83），因此，在遗传相似系数为0.83处划“种线”Line 1，基本上可将供试种进行有效区分。毛葡萄、腺枝葡萄、桑叶葡萄、网脉葡萄、秋葡萄、云南葡萄、菱叶葡萄、桦叶葡萄、美丽葡萄、山葡萄、刺葡萄、欧亚种及其杂种品种、刺葡萄、蘡薁葡萄、华东葡萄及其杂种品种、葛藟葡萄、沙地葡萄和河岸葡萄各成一类，呈并列关系。‘福建野葡萄’、‘万县野葡萄’与华东葡萄聚为一类。‘毛葡萄1099’与桑叶葡萄聚为一类，‘小黑葡萄’和‘燕山葡萄0947’材料各自为一类，变叶葡萄的10个株系被“种线”分成三类。

图3 根据ISSR结果构建的81份葡萄材料的树状关系图

Fig. 3 UPGMAdendrogram of 81 Vitis accessions were determined by ISSR

3 讨论

3.1中国野生葡萄的ISSR多态性分析

通过引物筛选发现二碱基重复引物尤其是CA和GA重复的引物扩增出的条带数量及多态性条带数较多（表2），这是由于与CA和GA重复序列结合的靶序列在葡萄属植物基因组DNA复制过程中存在滑动和不均等交换现象，使它们在不同种之间的重复次数差异较大从而较易引起引物结合位点之间的片段长度差异^[30]。这与Moreno S在利用ISSR检测不同来源的‘格列那什’（Garnacha）的12个变异单株多态性时，发现葡萄属植物中CA和GA二核苷酸重复序列较为丰富的结果一致^[29]。同时，表明葡萄属植物基因组中CA和GA重复序列较为丰富。

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