论文导读:：橄榄（Canariumalbum.L）。其遗传多样性水平也缺乏科学有效的评估。分析和电泳检测。对该地区橄榄种质资源一直缺乏系统的研究。
关键词：橄榄，遗传多样性，ISSR，种质资源
橄榄（Canarium album.L），属于橄榄科(Burseraceae)橄榄属(Canarium)，是我国南方重要的亚热带水果。其果实营养丰富，鲜食或加工均可，是卫生部批准的药食两用果品之一。粤东地区具有悠久的橄榄栽培历史并且保留了众多优质橄榄品种，当地至今仍保存着大量树龄达数百年的橄榄古树。但是，对该地区橄榄种质资源一直缺乏系统的研究论文网，其遗传多样性水平也缺乏科学有效的评估；同时粗放的种植和管理，导致一些优良的品种或特有的农家品种正逐渐减少或消失。因此，亟待开展相关的研究和保护。
近年来，随着PCR技术的发展，涌现出多种基于PCR的分子标记技术，并被广泛应用于植物种质资源亲缘关系以及遗传多样性的研究。其中，由Zietkiewicz等[1]提出的基于PCR的单引物ISSR(InterSimple Sequence Repeat)分子标记技术已在植物亲缘关系分析[2、3]、遗传多样性分析[4、5]、遗传图谱的构建[6]等方面广泛应用。DNA分子标记技术也被引入对橄榄的研究，如聂珍素[7]利用RAPD技术分析福建部分橄榄种质的亲缘关系；宋亚娜[8]通过ITS序列对14份福建橄榄进行鉴定和分类。本研究利用ISSR 标记技术对粤东地区64份橄榄种质的遗传多样性进行较为全面的调查研究以及评估，以期为该地区橄榄种质资源保护管理、核心种质建立以及进一步的育种计划提供相应的理论依据[F6]。
1. 材料和方法
1.1 材料来源
试验样品采集自粤东地区(汕头市、潮州市、揭阳市和梅州市)，共计64份橄榄(Canarium album.L)种质(见表1)。采样时摘取无损伤的叶片，放入封口袋并用硅胶干燥保存。
1.2 主要试剂和仪器
主要试剂：Taq DNA 聚合酶、dNTP和100bp DNA Ladder Marker均购自TaKaRa(宝)生物工程(大连)有限公司；ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学(Univesity ofBritish Columbia, Set.No.9, No.801-900)提供的序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自上海博彩生物科技有限公司。其他试剂为国产分析纯。
1.3 橄榄DNA提取
橄榄基因组DNA提取采用改良的CTAB法[9]，并用DNA纯化试剂盒对DNA原液做进一步纯化，具体步骤如下：1．取0.1克左右的材料置于陶瓷研钵中并加入液氮，充分研磨，成粉末状。2．往研钵中加入65℃预热的2×CTAB提取缓冲液论文网，将粉末状的材料研磨成匀浆并转入1.5ml离心管中，再加入适量的β巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温30-40min，期间不时摇动混匀。3．将离心管中的匀浆分装到两个1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，充分混匀，室温静置5min，室温下10000r/min离心10min。4．重复步骤3一次或两次。5．取上清液加2-2.5倍体积的无水乙醇，小心摇动，出现沉淀，得粗DNA。短时离心后倒掉上清液，于沉淀中加1mol/L NaCl 400μL，待沉淀溶解后，加等体积氯仿:异丙醇(24:1)论文网，摇匀，室温静置5min，室温下10000r/min离心10min。6．去上清加2-2.5倍体积的无水乙醇，小心摇动，使DNA沉淀。7．短时离心去除上清，加入70%乙醇洗涤沉淀、风干。8．将DNA溶解于100μlTE缓冲液，待DNA完全溶解后再用快速纯化试剂盒对DNA溶液进行纯化。9．用1.0%琼脂糖凝胶电泳（1×TAE）检测总DNA的质量，利用Biophotometer 生物分光光度计(德国 Eppendorf公司)测定DNA纯度和浓度，最后将DNA保存在-20℃冰箱里备用。
表1 供试橄榄种质材料
Table 1 Canarium album accessions used for[F7] this study
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编号Code
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品种Cultivar
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采集地Locality
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1
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果树所1号Guoshu No.1
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潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong
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2
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果树所2号Guoshu No.2
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潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong
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3
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果树所3号Guoshu No.3
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潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong
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4
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果树所4号Guoshu No.4
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潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong
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5
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马岗1号Magang No.1
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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6
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马岗2号Magang No.2
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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7
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马岗3号Magang No.3
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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8
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马岗4号Magang No.4
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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9
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马岗5号Magang No.5
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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10
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马岗6号Magang No.6
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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11
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东山1号Dongshan No.1
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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12
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东山3号Dongshan No.3
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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13
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东山5号Dongshan No.5
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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14
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锡1号Xi No.1
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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15
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鸣2号Ming No.2
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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16
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小丁香Xiaodingxiang
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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17
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香种Xiangzhong
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潮州市潮安县 Chaoan Chaozhou city Guangdong
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18
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黄都Huangdu
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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19
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下院Xiayuan
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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20
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烈火Liehuo
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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21
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三棱ⅡSanleng Ⅱ
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潮州市潮安县 Chaoan Chaozhou city Guangdong
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22
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青皮Qingpi
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潮州市湘桥区 Xiangqiao Chaozhou city Guangdong
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23
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西土Xitu
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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24
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鸡心Jixin
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汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong
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25
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三棱ⅠSanlengⅠ
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汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong
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26
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土纳 Tuna
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汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong
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27
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甜种 Tianzhong
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汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong
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28
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纳种 Nazhong
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汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong
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29
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土甜 Tutian
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汕头市潮阳区 Chaoyang Shantou city Guangdong
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30
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小黄仔 Xiaohuangzai
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潮州市果树研究所 Chaozhou Fruit Research Institute Guangdong
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31
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老鼠牙 Laoshuya
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潮州市潮安县 Chaoan Chaozhou city Guangdong
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32
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下赤 Xiachi
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潮州市潮安县 Chaoan Chaozhou city Guangdong
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33
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大普 Dapu
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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34
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细粒 Xili
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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35
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双湖香榄 Shuanghuxiang
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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36
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赤种仔榄 Chizhong
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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37
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揭西赤榄 Jiexichi
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揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong
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38
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普宁甜种榄 Puningtian
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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39
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广太青皮榄 Guangtaiqing
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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40
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普宁鸡心榄 Puningjixin
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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41
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大池甜榄 Dachitian
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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42
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铁节榄 Tiejie
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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43
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冬节园1号 Dongjieyuan No.1
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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44
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冬节园2号 Dongjieyuan No.2
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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45
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盐埕赤榄 yanchengchi
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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46
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凤湖榄 Fenghu
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揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong
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47
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麒麟纳种 Qilin
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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48
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揭西青皮 Jiexiqingpi
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揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong
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49
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大纳种榄 Dana
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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50
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赤种榄 Chizhong
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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51
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铁条榄 Tietiao
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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52
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车酸1号 Chesuan No.1
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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53
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东联香榄 Donglianxiang
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梅州市丰顺县 Fengshun Meizhou city Guangdong
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54
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大甜种 Datian
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梅州市丰顺县 Fengshun Meizhou city Guangdong
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55
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凤喜赤 Fengxichi
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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56
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四季榄 Siji
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揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong
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57
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蟹目榄 Xiemu
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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58
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鸿运榄 Hongyun
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揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong
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59
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广太甜榄 Guangtaitian
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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60
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杂赤榄 Zaichi
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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61
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澄皮榄 Chengpi
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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62
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大纳甜种 Danatian
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揭阳市揭西县 Jiexi Jieyang city Guangdong
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63
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大红心榄 Dahong
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揭阳市普宁市 Puning Jieyang city Guangdong
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64
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双罗 Shuangluo
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潮州市饶平县 Raoping Chaozhou city Guangdong
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1.4 ISSR分析和电泳检测
ISSR引物序列参照UBC引物set#9(University of British Columbia, Canada)，从随机选取的48个引物中筛选出8个能够获得清晰条带、重复性高的引物用于此次分析。采用20μL反应体系，其中包括2μL10×PCR buffer，Mg2+ 3.0mmol/L，dNTP 0.225mmol/L，Taq DNA 聚合酶1U，模板DNA80ng和引物0.25μmol/L。PCR扩增在Biometra T-personal型PCR仪(德国Biometra公司)上进行论文网，扩增程序为：94℃预变性4min；30个循环，每个循环94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1.5min；72℃延伸8min；最后4℃保存。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶中含0.5μg/mL EB，电极缓冲液为0.5×TBE，电压为2.5V/cm，以100bp DNA Ladder Marker作为标准分子量对照。电泳结束后使用Gene Genius 凝胶成像系统(英国Syngene公司)拍照。PCR反应重复3次。1.5 数据处理
电泳图谱上同一位点处有清晰、重复出现电泳条带记为“1”，无条带、弱带或重复性差记为“0”，形成原始数据矩阵。利用NTSYS-pc 2.10e 软件，根据Dice算法计算种质之间的相似性系数，并进行聚类分析和主坐标分析。对聚类结果和相似性矩阵进行Mantel相关性检验。利用POPGENE32计算利Shannon’s信息指数(I)、有效等位基因数(Ne)、观察等位基因数(Na)和Nei’s基因多样性(H)等遗传多样性指数。
2. 结果与分析
2.1 ISSR分析
8条引物对64份种质进行ISSR扩增，总共获得128个条带，其中多态性条带99条，多态性比率为77.34%(见表2、图1)。每个引物产生13-19条谱带论文网，平均每个引物产生16条谱带。每个引物可得到7-17条多态性条带，平均每个引物产生12.4个多态性标记。表明ISSR分子标记技术可以在橄榄种质分析中获到丰富的信息量。
以基因位点的等位基因频率为基础的Shannon’s信息指数(I)、有效等位基因数(Ne)、观察等位基因数(Na)和Nei’s基因多样性(H)等遗传多样性指数，以往多见于居群遗传多样性分析，但近来也出现于品种的分析[10-15]。此次研究结果表明，64份橄榄种质的平均观察等位基因数为1.7734±0.4203，有效等位基因数为1.4823±0.3888，Nei’s基因多样性为0.2746±0.1975和Shannon’s信息指数0.4072±0.2721。相比较于ISSR在茶树种质资源[11、13]的分析中得到的遗传多样性指数，本研究中有效等位基因数、Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数均较低，这也反映了供试种质总体遗传多样性水平较低。
 
图1 引物UBC-840对64份材料的扩增结果电泳图谱
Fig. 1. Amplified profiles of 64 test accessions by using primer[F8] UBC-840
注：1―64 为样品编号（见表1）；M: DNA Marker
No.1―64 are the accessionsnumber in table 1；M showed 100bp DNA Ladder Marker
表2 8个ISSR引物对64份橄榄种质的扩增结果
Table 2 8 ISSR primers and theirs[F9] amplified bands in 64 accessions of Canariumalbum
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引物
Primer
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引物序列(5’-3’)
Sequnence of primers
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扩增条带数
Number of amplified bands
|
多态性条带数
Number of polymorphic bands
|
多态性比率(%)
Percentage of polymorphic bands(%)
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836
|
(AG)8YA
|
16
|
12
|
75.00%
|
|
840
|
(GA)8YT
|
13
|
7
|
53.85%
|
|
841
|
(GA)8YC
|
18
|
15
|
83.33%
|
|
886
|
VDV(CT)7
|
13
|
11
|
84.62%
|
|
887
|
DVD(TC)7
|
19
|
17
|
89.47%
|
|
888
|
BDB(CA)7
|
15
|
12
|
80.00%
|
|
889
|
DBD(AC)7
|
19
|
16
|
84.21%
|
|
891
|
HVH(TG)7
|
15
|
9
|
60.00%
|
|
总计Total
|
|
128
|
99
|
|
|
平均Average
|
|
16
|
12.4
|
77.34%
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2.2 遗传相似性分析
根据数据矩阵利用Dice法计算种质间的相似性系数。由结果可知，64份橄榄种质之间遗传相似性系数范围是0.5714-0.9379，平均遗传相似性系数为0.7793；遗传相似性最低的是‘马岗6号’和‘鸡心’，相似性系数为0.5714，‘冬节园1号’和‘冬节园2号’遗传相似性最高，为0.9379。
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