葡萄果实中脱落酸受体ABAR/CHLH基因的克隆及其表达分析

论文导读:：葡萄属于典型的非呼吸跃变型果实。关于ABA对葡萄果实发育的影响。脱落酸受体ABAR（putativeabscisicacidreceptor）。葡萄中ABAR/CHLH蛋白不仅与高等植物具有较高的同源性。
论文关键词：葡萄，果实发育，脱落酸，ABAR/CHLH

 

果实成熟是植物体一个独特的发育过程，它涉及了我们的食品、营养和健康。因此，果实成熟的调控相关研究引起了植物学家普遍的关注。根据果实成熟的特点，果实可分为呼吸跃变及非呼吸跃变两个基本类型。葡萄属于典型的非呼吸跃变型果实。多年来，以呼吸跃变型番茄果实为试材，以乙烯受体及其信号传导分子机制为基础, 植物学家已经揭示了乙烯调控番茄成熟的分子机理^[1-2]。目前虽然对呼吸跃变型果实成熟的激素分子机理研究取得了很大的进展，但对非跃变型果实（例如葡萄）成熟调控的分子机理了解却相对贫乏。

植物激素脱落酸（abscisic acid, ABA）被认为在非跃变果实成熟调控中起着关键的作用^[3]。但由于脱落酸(abscisic acid, ABA)受体鉴定工来在模式植物上作近年才取得实质性突破^[4-9]，因此，以ABA受体及其信号传导为基础研究葡萄果实成熟调控的分子机制才刚刚起步。脱落酸受体ABAR（putativeabscisic acid receptor），一种ABA特异结合蛋白，它介导了拟南芥种子萌发、幼苗生长和叶片气孔运动生物论文，并发现ABAR基因编码了一个已知蛋白质, 即定位于质体内参与催化叶绿素合成的镁离子螯合酶H亚基（H subunit of magnesiumchelatase, CHLH）^[4]。目前，关于脱落酸受体ABAR/CHLH是否参与葡萄果实发育的调控还不清楚，因此，本研究以玫瑰香葡萄果实为试材，克隆并分析了脱落酸受体基因ABAR/CHLH在果实成熟发育过程中表达水平的变化，为葡萄果实成熟调控的分子机制研究奠定基础论文发表。

1 材料与方法

1.1 材料

试材为北京农学院实验园8年生玫瑰香葡萄（Vitis vinifera L. cv. Muscat Hamburg），树势偏弱。实验园为壤土，肥水条件良好，采用单壁篱架，株行距为1.0m×1.5m，南北行向，管理水平良好。花后8周开始采样，每周采样1次，每次随机选取３串葡萄，从果穗上中下部共取15粒葡萄果实，采后立即液氮保存，贮存于-80℃超低温冰箱备用。

表1 葡萄果实取材时期（花后周数）

．Sampling stagesof grape berry（weeksafter anthesis）

table1

注：图片仅代表颜色的变化过程。

Note：Pictures onlyrepresent the changing process of berry color.

试剂PVPP，CTAB购自Sigma，DH5α大肠杆菌感受态购自北京全式金，pMD19-T、LA Taq、SYBR premix Ex Taq购自Takara，引物合成和测序工作委托上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

葡萄果实总RNA的提取参照朱晓琴改良的CTAB法^[10]。在1%非变性琼脂糖凝胶中检测总RNA的完整性，并且用eppendorf BioPhotometer测定总RNA的浓度和260/280、260/230值。利用M-MLV 逆转录酶和Clotech SMART^TMLibrary（Clotech）合成3'-RACE cDNA模板。

1.2.2葡萄脱落酸受体ABAR/CHLH基因的克隆 根据Genebank上已公布的草莓CHLH基因序列通过BLAST比对得到一个类似葡萄CHLH mRNA序列。设计引物P1：5'-ATGGCTTCTTTGGTGTCTTCC-3'进行3'-RACE PCR.第一轮RT-PCR以P1和UPM为引物，PCR反应条件为94℃预变性5min生物论文，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min。第二轮以P1和NUP套嵌引物为引物，第一轮PCR产物稀释50倍为模板，PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸4min，33个循环；72℃延伸10min。PCR产物置0.8%琼脂糖中电泳，胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物与pMD19-T载体连接后转化E.coli DH5α感受态细胞，菌液PCR检测是否有插入片段，挑选阳性克隆测序。

1.2.3 基因组DNA的提取及Southern Blot分析 采用植物基因组提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）提取葡萄幼嫩叶片基因组DNA，使用eppendorfBioPhotometer测定DNA的浓度和质量。以BamHⅠ、SpeⅠ和XbaⅠ在30℃、37℃和37℃单酶切基因组DNA 8h，每条泳道加载15μg DNA 酶切产物，在0.8%琼脂糖凝胶中30V电泳8h，转膜过程参见分子克隆^[11]。

根据上述测序结果设计探针特异引物，AP1：5'-CCCTCTTCAGGACGGTTCA-3'，AP2：5'-TTCACTTTGGCACTCACGG-3'。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s生物论文，32个循环；72℃延伸10min。探针制备和杂交膜的显色分别按DIG DNA PCR标记试剂盒和DIG NBT/BCIP显色试剂盒（北京美莱博医学科技有限公司）说明书进行。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 Real-timeRT-PCR采用SYBR PremixEx Taq试剂盒（TaKaRa），PCR仪型号为BIO-RAD iQ5荧光定量PCR仪，反应总体积20μL，包括2×SYBR Green PCR混液10μL，cDNA模板2μL，正反向引物各0.4μL(10μM)，用RNase free水补足至总体积20μL。

VvCHLH：上游 5'-CTGAGCCTCTGTTCCTTCC-3'；下游5'-TCGTGGCGTTCACTATCTGC-3′

VvActin： 上游5'-AATGTGCCTGCCATGTATGT-3'；下游5′--GTCCAGCAAGGTCAAGACG-3′

PCR程序为：95℃ 2min,95℃ 20s, 54℃ 20s, 72℃ 20s, 40个循环，最后溶解从60℃到95℃，每个循环0.5℃ 30s。实验重复三次论文发表。

1.2.5 葡萄果肉ABA含量的测定 葡萄果肉ABA含量的测定方法参照李春丽^[12]。

2 结果与分析

2.1 葡萄果实中ABAR/CHLH基因的克隆及其生物信息学分析

结合RT-PCR和3'- RACE A 技术从葡萄果实中克隆了脱落酸受体ABAR/CHLH 4302-bpcDNA 基因片段，该片段编码了一个分子量为153 ku 含有1381个氨基酸的多肽（图1，GenBank注册号：GU723472）。

在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 上通过氨基酸基酸水平同源分析发现，葡萄中ABAR/CHLH蛋白不仅与高等植物具有较高的同源性，如大豆 92%（Glycine max, CAA04526)、蓖麻 92%（Ricinus communis，XP_002532078）、 桃 91%（Prunus persica，AC057443)、金鱼草 90% （Antirrhinum majus，CAA51664)、烟草 90% （Nicotiana tabacum, AAB97152)、草莓 88% （Fragaria ananassa，ACS94977)、拟南芥86% （Arabidopsisthaliana ，CAA92802 ）、 水稻 85% （Oryza sativa，ABF95686）和大麦84% （Hordeum vulgare，AAK72401), 而且同低等的光合生物具有相对较高的同源性，例如绿藻 69%（Chlamydomonas reinhardtiis, XP_001700895）, 聚球藻 68% (Synechococcus ,YP_001734277),蓝藻 68% (Cyanobacteria,YP_002485640), 表明该在蛋白进化上高度保守。

葡萄与上述9种植物CHLH/ABAR 蛋白质序列用MEGA 4. 1 软件采用邻接法( NJ) 和Bootstrap 的

1000 次重复检测方法进行亲缘关系分析，结果表明在遗传进化上主要分为2 类，葡萄首先与大豆及大麦聚为一类生物论文，然后与金鱼草和烟草聚为一类，再与草莓、桃和蓖麻聚为一大类，最后与拟南芥聚为一类。水稻与其他植物亲缘关系较远，单独聚为一类(图2)。使用网络DAS服务器（http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS）对CHLH/ABAR 蛋白序列进行跨膜结构预测。在strict cut-off 严格条件限制下，该蛋白分别在142-145、387-392和 418-422 氨基酸之间存在3个跨膜区域 (图3)。

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