论文摘要：利用TP-M13-SSR的方法对河北收集的八棱海棠资源的遗传多样性和亲缘关系进行研究。16对TP-M13-SSR引物对34份材料进行扩增出205个等位基因，平均每个位点12.8个等位基因。分析结果表明，除山荆子、海棠花和绵苹果外的31份八棱海棠材料的遗传系数为0.7879，平均位点杂合度为0.8413，平均多态性信息含量为0.7592；河北怀来的八棱海棠与海棠花、山荆子的相似系数高于小矾山和大古城产地，其与山荆子和海棠花的亲缘关系可能要近于后两者；三块石海棠1与绵苹果的相似系数最高，在起源演化上可能要晚于其他的海棠类型；系统聚类分析结果显示，所有供试材料主要分为两大类，与起源演化相关，第一类为野生种海棠花和山荆子，第二类主要为绵苹果和八棱海棠的各地方类型品种。河北怀来可能是八棱海棠主要的原始起源地区，与其他地区相比，小矾山地区八棱海棠与其亲缘更近。
论文关键词：八棱海棠,遗传多样性,亲缘关系
八棱海棠，又叫怀来海棠，原产于怀来县，可能是山定子和海棠果的杂交种，有千余年的栽培历史。其树体具有结果早、产量高、适应性广、抗性强和与栽培品种的亲和性好等特点；而果实则具有果形美、色泽好、含糖量高、耐贮运、口味佳等优点，既可以生食，也是加工的好原料。因此八棱海棠既可以用作砧木又可以用作水果生产，也因此而成为目前中国应用最广泛的苹果砧木之一。八棱海棠因是实生繁殖，其类型很多，如冷海棠、热磙子、六轴滚海棠、圆海棠、牛妈奶海棠、平顶海棠、热海棠等，以往对于八棱海棠的研究多注重于提高其抗性以作砧木利用方面，但对于八棱海棠的遗传多样性和亲缘演化关系研究甚少。
本研究针对河北不同地区收集的部分八棱海棠资源进行TP-M13-SSR的遗传多样性和亲缘关系分析，旨在为今后八棱海棠资源的进一步收集和鉴定评价提供基础，并为其利用和种质开发等提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
试验材料取自河北怀来、大古城、小矾山、三块石等八棱海棠的密集分布区，共计31份；此外，山定子、海棠果和绵苹果则取自中国农业科学院果树研究所国家果树种质兴城苹果资源圃。材料名称及编号见表1。
表134份供试苹果材料
Table134materialsforTP-M13-SSRanalysis
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编号
code
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材料名称
Material name
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学名
Book name
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1
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海棠花Haitanghua
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M.prunifolia(Willd.)Borkhausen
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2
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绵苹果Mianpingguo
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M.domestica Borkh.
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3
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山荆子Shanjingzi
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M.baccata(L.)Borkh
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4
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怀来八棱海棠Huailaibalenghaitang
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M.robusta Rehd.
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5
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河北八棱Hebeibaleng
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M.robusta Rehd.
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6
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大古城八棱海棠实生Daguchengbalenghaitangshisheng
|
M.robusta Rehd.
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7
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小矾山八棱Xiaofanshanbaleng
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M.robusta Rehd.
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8
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小矾山八棱1号Xiaofanshanbaleng1hao
|
M.robusta Rehd.
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9
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紫色小矾山八棱Zisexiaofanshanbaleng
|
M.robusta Rehd.
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10
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小矾山八棱海棠实生Xiaofanshanbalenghaitangshisheng
|
M.robusta Rehd.
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11
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小矾山海棠2号Xiaofanshanhaitang2hao
|
M.robusta Rehd.
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12
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小矾山海棠2号实生Xiaofanshanhaitang2haoshisheng
|
M.robusta Rehd.
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13
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沁源滦庄沙果Qinyuanluanzhuangshaguo
|
M.robusta Rehd.
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14
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滦庄沙果实生Luanzhuangshaguoshisheng
|
M.robusta Rehd.
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15
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平顶海棠Pingdinghaitang
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M.robusta Rehd.
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16
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河北平顶海棠实生Hebeipingdinghaitangshisheng
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M.robusta Rehd.
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17
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红海棠Honghaitang
|
M.robusta Rehd.
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18
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冷海棠Lenghaitang
|
M.robusta Rehd.
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19
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冷海棠实生Lenghaitangshisheng
|
M.robusta Rehd.
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20
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小矾山海棠4号Xiaofanshanhaitang4hao
|
M.robusta Rehd.
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21
|
小矾山海棠实生Xiaofanshanhaitangshisheng
|
M.robusta Rehd.
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22
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三块石海棠1号Sankuaishihaitang1hao
|
M.robusta Rehd.
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23
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三块石海棠2号Sankuaishihaitang2hao
|
M.robusta Rehd.
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24
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三块石海棠1号实生Sankuaishihaitang1haoshisheng
|
M.robusta Rehd.
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25
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三块石海棠2号实生Sankuaishihaitang2haoshisheng
|
M.robusta Rehd.
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26
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短枝磙子Duanzhigunzi
|
M.robusta Rehd.
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27
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短枝磙子实生Duanzhigunzishisheng
|
M.robusta Rehd.
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28
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热磙子Regunzi
|
M.robusta Rehd.
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29
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热磙子实生Regunzishisheng
|
M.robusta Rehd.
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30
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光面磙子实生Guangmiangunzishisheng
|
M.robusta Rehd.
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31
|
早白海棠Zaobaihaitang
|
M.robusta Rehd.
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32
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晚白海棠Wanbaihaitang
|
M.robusta Rehd.
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|
33
|
晚白海棠实生Wanbaihaitangshisheng
|
M.robusta Rehd.
|
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34
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玲铛果Lingdangguo
|
M.robusta Rehd.
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1.2实验方法及数据处理
采用德国QIAGEN的DNeasyPlantMiniKit提取供试材料的基因组DNA。本实验选用的30对普通的SSR引物序列均来源于Yamamoto等、R.Liebhard等报道的序列，TP-M13-SSR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，5’端带有荧光标记的M13正向引物（其名称及序列见表2）则由美国ABI公司合成。
表25’端带有荧光标记的M13正向引物及序列
Table2TheM13forwardprimerfluorescent-labelledat5’end
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引物名称
Primer Name
|
标记荧光
Fluorescent labelled
|
引物序列（5’－3’）
Primer Sequence
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M13-B
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6FAMTM
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5’6FAMTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3’
|
|
M13-G
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VICTM
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5’VICTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3’
|
|
M13-Y
|
NEDTM
|
5’NEDTM-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3’
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参照Schuelke（2000）提供的巢式PCR，经优化确定为：第一次PCR的10ul反应体系含15～20ng基因组DNA，F-primer0.024μM，R-primer0.24μM，10×PCRbuffer（不含Mg）1μL，Mg2mM，dNTP0.25mM，Taq聚合酶0.6U；第二次PCR以第一次PCR产物为模板，在其中继续加入5’端带有荧光标记的M13正向引物（2μmol/L）1.8μL，10×PCRbuffer（不含Mg）0.1μL，Taq酶(5U/μL)0.08μL，ddHO0.12μL；第一次PCR程序为94℃5min，94℃45s、An.T45s、72℃45s、35个循环，72℃10min，4℃保存待用；第二次PCR程序为94℃5min、94℃30s、53℃30s、72℃30s、16个循环，72℃10min，4℃保存待用；PCR产物经过纯化后，利用ABI3730进行自动荧光检测。待电泳结束后，对样品的原始数据用GeneMapper3.0软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度，再利用PowerMarkerV3.25、PopGene1.31和NTSYSpc2.1对供试材料进行遗传多样性和聚类分析。
2结果与分析
2.1TP-M13-SSR引物的筛选及条件优化
对合成的30对TP-M13-SSR引物进行筛选，初步筛选出稳定性高、重复性好、PCR条件稳定的16对引物，用于34份材料的荧光标记鉴定和遗传多样性研究，引物名称及序列具体见表3。
表316对TP-M13-SSR引物及优化条件
Table316PairsofTP-M13-SSRPrimersandOptimumConditions
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引物名称
Primer Name
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正向引物序列（5’－3’）
Forward Primer Sequence
|
反向引物序列（5’－3’）
Reverse Primer Sequence
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退火温度
Annealing temperature (℃)
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KA4b
|
F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-AAA GGT CTC TCT CAC TGT CT
|
R:CCT CAG CCC AAC TCA AAG CC
|
48
|
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BGT23b
|
F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-CAC ATT CAA AGA TTA AGA T
|
R:ACT CAG CCT TTT TTT CCC AC
|
50
|
|
CH01f03b
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GAG AAG CAA ATG CAA AAC CC
|
R:CTC CCC GGC TCC TAT TCT AC
|
58
|
|
CH02b121
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GGC AGG CTT TAC GAT TAT GC
|
R:CCC ACT AAA AGT TCA CAG GC
|
59
|
|
CH03d07
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-CAA ATC AAT GCA AAA CTG TCA
|
R:GGC TTC TGG CCA TGA TTT TA
|
51
|
|
CH04e03
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-TTG AAG ATG TTT GGC TGT GC
|
R:TGC ATG TCT GTC TCC TCC AT
|
60
|
|
CH04h02
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GGA AGC TGC ATG ATG AGA CC
|
R:CTC AAG GAT TTC ATG CCC AC
|
55.5
|
|
CH05c06
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ATT GGA ACT CTC CGT ATT GTG C
|
R:ATC AAC AGT AGT GGT AGC CGG T
|
58
|
|
CH05d08
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-TCA TGG ATG GGA AAA AGA GG
|
R:TGA TTG CCA CAT GTC AGT GTT
|
55.5
|
|
CH02a04
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-GAA ACA GGC GCC ATT ATT TG
|
R:AAA GGA GAC GTT GCA AGT GG
|
58
|
|
CH05b06
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ACA AGC AAA CCT AAT ACC ACC G
|
R:GAG ACT GGA AGA GTT GCA GAG G
|
55
|
|
CH05d04
|
F: CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-ACT TGT GAG CCG TGA GAG GT
|
R:TCC GAA GGT ATG CTT CGA TT
|
60
|
|
CH01f07a
|
F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CCC CTA CAC AGT TTC TCA ACC C
|
R:CGT TTT TGG AGC GTA GGA AC
|
59
|
|
CH04g07
|
F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CCC CTA ACC TCA ATC CCC AAT
|
R:ATG AGG CAG GTG AAG AAG GA
|
57
|
|
CH05e04
|
F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CAA GGA GAA GAC CGT GTG AAA TC
|
R:CAT GGA TAA GGC ATA GTC AGG A
|
57
|
|
CH05h12
|
F:CAC GAC GTT GTA AAA CGA CTT GCG GAG TAG GTT TGC TTT
|
R:TCA ATC CTC ATC TGT GCC AA
|
60
|
2.2品种鉴定和遗传多样性分析
通过实验准确获得了34份材料在16个SSR位点的TP-M13-SSR扩增数据，图1为引物对CH01f03b对不同品种检测的指纹图谱。16对TP-M13-SSR引物对34份材料进行扩增出205个等位基因，平均每个位点12.8个等位基因。引物对CH04h02区分率最高达73.5％，梨SSR引物BGT23b区分率最低仅为11.76％，其中，紫色小矾山八棱和小矾山海棠4的扩增结果完全相同。除山定子、海棠花和绵苹果外，16个SSR位点所揭示出的31份八棱海棠资源的遗传多样性的变化范围为0.4995～0.8856，多态性信息含量的变化范围为0.3747～0.8758，两者中，最高的均是CH04h02，最低的均是BGT23b，平均值分别为0.7880和0.7592；预期杂合度的变化范围为0.4138～0.9677，平均值为0.8413。（见表4）
表416个SSR位点在31份八棱海棠资源上检测到的遗传多样性
Table4Geneticdiversityof31cultivarsofMalusrobustaRehd.revealedby16SSRprimers
|
标记
Marker
|
主等位基因频率
Major.Allele.Frquency
|
基因型数Genotype No.
|
等位基因数Allele No.
|
基因多样性
Gene Diversity
|
杂合度Heterozygosity
|
多态性信息含量PIC
|
|
KA4b
|
0.4138
|
9
|
5
|
0.7063
|
0.4138
|
0.6589
|
|
BGT23b
|
0.5161
|
3
|
2
|
0.4995
|
0.7097
|
0.3747
|
|
CH01f03b
|
0.3387
|
13
|
7
|
0.7784
|
0.9355
|
0.7468
|
|
CH02b12
|
0.2258
|
19
|
12
|
0.8512
|
0.8065
|
0.8349
|
|
CH03d07
|
0.4516
|
13
|
12
|
0.7279
|
0.9677
|
0.6975
|
|
CH04e03
|
0.2097
|
20
|
15
|
0.8720
|
0.9355
|
0.8595
|
|
CH04h02
|
0.2167
|
22
|
17
|
0.8856
|
0.9667
|
0.8758
|
|
CH05c06
|
0.3103
|
17
|
15
|
0.8199
|
0.9655
|
0.7998
|
|
CH05d08
|
0.2742
|
15
|
11
|
0.8137
|
0.7419
|
0.7892
|
|
CH02a04
|
0.3548
|
16
|
13
|
0.7981
|
0.8710
|
0.7755
|
|
CH05b06
|
0.3226
|
17
|
20
|
0.8377
|
0.9677
|
0.8233
|
|
CH05d04
|
0.4516
|
14
|
12
|
0.7409
|
0.8387
|
0.7168
|
|
CH01f07a
|
0.2321
|
19
|
15
|
0.875
|
0.8571
|
0.8636
|
|
CH04g07
|
0.2903
|
18
|
14
|
0.8304
|
0.8065
|
0.8118
|
|
CH05e04
|
0.2581
|
19
|
14
|
0.8632
|
0.7742
|
0.8499
|
|
CH05h12
|
0.4516
|
11
|
9
|
0.7076
|
0.9032
|
0.6694
|
|
平均
Average
|
0.3324
|
15.3
|
12.1
|
0.7880
|
0.8413
|
0.7592
|
图1TP-M13-SSR所检测的苹果不同品种在SSR位点CH01f03b的指纹图谱
Chart1ThefingerprintingrevealedbyTP-M13-SSRindifferentapplecultivarsatCH01f03b
2.3亲缘与聚类分析
河北怀来的八棱海棠与海棠花和山荆子的相似系数分别为0.8146和0.7854，均高于小矾山和大古城等地收集的；而三块石海棠1与绵苹果的相似系数最高，为0.8780。
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