论文摘要：用ISSR分子标记技术分析了25份来自中越金柑属种质资源与金弹变异系的亲缘关系及特异性。从100条引物中筛选出10条多态性好、扩增清晰的引物。结果显示: 10条引物共扩增出120条带，其中102条具有多态性，多态性带比率为85%。用UPGMA软件进行聚类分析，25份金柑种质资源的遗传相似系数在0.48-0.99之间，在遗传系数为0.85水平处将25份供试资源划分为8类，对聚类结果进行分析。中越边境野生山桔（金柑）资源可能为新种类或变种。
论文关键词：金柑,种质资源,亲缘关系,金弹变异系
金柑为芸香科（Rutaceae）柑橘亚科(Aurantioideae)金柑属(FortunellaSwingle)植物，共有4个种和3个杂种（包括四季桔）。金柑一年能多次开花多次结果。其树姿优美，常年花、果同生，果实形美色艳，有吉祥喜庆之寓意。金柑果实营养价值极高，风味独特，是鲜食、加工及观赏的多用果树。
金柑原产我国，栽培历史悠久，分布范围广，然而目前生产上栽培的金柑优良品种极少，主要鲜食品种只有金弹一种，严重限制了产业的可持续发展。为了更好地利用金柑属野生种质、引进资源及栽培种的变异系，以选育出满足消费者需求的鲜食、加工、观赏及多用型的金柑新品种，有必要对收集到的金柑属资源特别是野生种质、栽培种的变异系进行亲缘关系分析。其中，对中越边境金柑野生资源、越南金柑资源及金弹变异系的遗传分析尚未见报道。
本研究采用ISSR-PCR分析的方法，对25份不同来源的金柑资源进行亲缘关系及特异分子标记分析，为金柑属种质资源的合理利用及新品种选育提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
供试的25份资源分别来自广西融安、阳朔、广东顺德、广西大学、中国农科院柑桔研究所及越南。其详细信息见表1。
表1供试材料名称及来源
Table1Nameandoriginofthematerials
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编号Code
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资源名称
Name & species
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来源地
origin
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1
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融安金弹
F.crassifolia Swingle
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融安
Rongan
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2
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融安滑皮金柑
Ronganhuapijingan
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融安
Rongan
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3
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融安滑皮金柑珠心苗
Nucellar seedling of Ronganhuapijingan
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广西大学
Guangxi University
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4
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阳朔金弹1号
F.crassifolia Swingle 1
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阳朔
Yangshuo
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5
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阳朔金弹2号
F.crassifolia Swingle 2
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阳朔.
Yangshuo
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6
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阳朔金弹3号
F.crassifolia Swingle 3
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阳朔
Yangshuo
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7
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长寿金柑
F. obovata Tanaka
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顺德
Shunde
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8
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长寿金柑珠心苗
Nucellar seedling of F. obovata Tanaka
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广西大学
Guangxi University
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9
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金枣
F. margarita Swingle
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顺德
Shunde
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10
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金枣实生苗
Seedling of F. margarita Swingle
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广西大学
Guangxi University
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11
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山桔（金柑）
Shanju
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中越边境
Sino-vietnamese border
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12
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诱变金柑1号
Youbianjingan1
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广西大学
Guangxi University
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13
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诱变金柑2号
Youbianjingan2
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广西大学
Guangxi University
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14
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四季桔
Calamondin
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广西大学
Guangxi University
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15
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越南金柑1号
Yuenanjingan 1
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越南
Vietnam
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16
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越南金柑2号
Yuenanjingan 2
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越南
Vietnam
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17
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越南金柑3号
Yuenanjingan3
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越南
Vietnam
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18
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越南金柑4号
Yuenanjingan4
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越南
Vietnam
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19
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越南金柑5号
Yuenanjingan5
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越南
Vietnam
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20
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越南金柑6号
Yuenanjingan6
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越南.
Vietnam
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21
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宁波罗纹
F.japonica Swingle
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中国农业科学院柑桔研究所
Citrus Research Institute, CAAC(Chinese Academy of Agricultural Sciences)
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22
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福建金豆
F．hindsii var.Chinton
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中国农业科学院柑桔研究所
Citrus Research Institute, CAAC
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23
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金豆（2002-29）
F．hindsii var.Chinton
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中国农业科学院柑桔研究所
Citrus Research Institute, CAAC
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24
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金豆（2002-30）
F．hindsii var.Chinton
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中国农业科学院柑桔研究所
Citrus Research Institute, CAAC
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25
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金豆（2002-36）
F．hindsii var.Chinton
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中国农业科学院柑桔研究所
Citrus Research Institute, CAAC
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1.2方法
1.2.1基因组DNA的提取和检测
采健康幼嫩的叶片，用改良CTAB法提取金柑叶片基因组DNA，用1%琼脂凝胶电泳检测DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度与纯度。最后将DNA稀释至50ng·μL，于-20℃冰箱备用。
1.2.2引物筛选
本试验选用的100条ISSR引物由上海生物工程合成，经过反复试验筛选出10条多态性较好的引物用于供试种金柑质资源遗传多样性分析。
1.2.3PCR扩增
采用以下优化后的反应体系进行PCR扩增：DNA(50ng·μL)1.0μL、10×buffer(含Mg)2.0μl、4.0mmol/LdNTP0.5μL、30μmol/L引物1μl、DNA聚合酶(2.5U·μL)0.4μL，加水至20μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性50s，复性退火温度1min，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸7min。扩增反应结束后，在扩增产物中加入4μl溴酚蓝混匀，取8μl扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液为1×TAE，EB染色，拍照。
1.2.4资源的聚类分析
谱带记录以电脑记录的荧光条带为依据，有条带则多态性记为“l”，空缺时记为“0”，把得到的0，1矩阵输人NTsys2.10e，用NTsys2.10e软件计算遗传相似性系数，并用UPGMA程序构建聚类图。
2结果与分析
2.1引物筛选及ISSR-PCR多态性分析
从100条ISSR引物中筛选出10个条带清晰多态性好、比较稳定的引物，用其对所有供试资源进行ISSR-PCR扩增，共扩增出120条带，其中具有多态性的共102条，多态性比率为85%。平均每条引物可获得12条带，平均多态性条带为10.2条（表2），扩增产物条带介于100-2000bp间（图1）。其中引物U812扩增出的多态性比例最大，达100%。说明供试样品遗传多样性较丰富。
表210条ISSR引物序列及扩展结果
Table2Thesequencesof10ISSRprimersandamplifiedresults
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引物
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引物序列（5′-3′）
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条带总数
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多态性位点
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多态性位点百分数（%）
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Primer
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Sequences （5′-3′）
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No. of securable bands
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No. of polymorphic bands
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Percentage of polymorphic loci(%)
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U807
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(AG) T
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12
|
10
|
83
|
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U808
|
(AG)
|
13
|
10
|
77
|
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U812
|
(GA)
|
13
|
13
|
100
|
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U810
|
(GA) T
|
9
|
6
|
67
|
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U857
|
(AC) YG
|
12
|
10
|
83
|
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U841
|
(GA) YC
|
13
|
12
|
92
|
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U834
|
(AG) TG
|
12
|
10
|
83
|
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U813
|
(CT) T
|
8
|
6
|
75
|
|
U842
|
(GA) YG
|
10
|
8
|
80
|
|
U855
|
(AC) YT
|
18
|
17
|
94
|
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总数Sum
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|
120
|
102
|
85
|
|
平均Average
|
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12
|
10.2
|
85
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图1引物U834扩增金柑种质资源的ISSR电泳图
泳道:M:DL2000marker；其它泳道编号代表的样品名称参见表1。
Fig.1ElectrophoresispatternamplifiedfromFortunellaGermplasmResourceswithprimer834
Note:M:DL2000marker;1~24:FortunellaGermplasmResourcescodeNo.seenintable1
2.2亲缘关系分析
用Ntedit软件计算10条ISSR引物扩增结果在每个供试资源之间的相似系数，结果显示：在供试的25份材料中，不同资源间遗传相似系数的范围为0.48~0.99。用UPGMA法构建亲缘关系树状图（图2）。在遗传相似系数为0.85的水平上，25份资源资源可分为8组：第1组包括：融安金弹、阳朔金弹1号、阳朔金弹2号、阳朔金弹3号、融安滑皮金柑、诱变金柑1号、诱变金柑2号（材料1~6,12,13）；第2组包括：金枣及其实生后代、越南金柑6号、宁波罗纹（材料9、10、20、21）；第3组包括：长寿金柑及其实珠心苗（材料7、8）；第4组：福建金豆（材料22）；第5组包括：金豆2002-29、金豆2002-30和金豆2002-36（材料23、24、25）；第6组：山桔（金柑）（材料11）。 1/2 1 2 下一页 尾页 |
