论文导读:：君迁子作为与柿的亲缘关系较近。许多主栽柿品种来自芽变[8]。本试验通过逆转座子分子标记技术。由UPGMA聚类所得的树状图（图2）可见。
论文关键词：品种鉴定，亲缘关系，芽变，逆转座子分子标记，UPGMA
植物基因组40％-60％为逆转座子，其在纵向和横向传递中能产生高度的异质性和拷贝数，且易被生物和非生物因素差异激活，成为植物遗传多样性的重要来源。基于逆转座子的分子标记是检测基因组变异的手段之一亲缘关系，尤其是Kalendar等[1]开发的逆转座子间扩增多态性（inter-retrotransposon amplified polymorphism，IRAP）技术，操作简单、多态性丰富、检测效率高，已在种质鉴定[2, 3, 4, 5]、遗传多样性检测和系统发育重建[6]、基因作图以及重要农艺性状基因的标记[7]等方面得到成功应用。
芽变是多年生木本果树植物新品种选育的重要变异来源，许多主栽柿品种来自芽变[8]。‘磨盘柿’原产我国，分布最广、面积最大，长期的营养繁殖可能已经积累许多变异类型，但早期采用的形态学鉴定由于环境条件和技术人员的主观因素等原因往往影响鉴定结果的真实性。常规分子标记一般难以准确鉴定芽变单株[9, 10, 11]论文网站大全。基于逆转座子的分子标记技术可能对变异微小的单株鉴别更为有效[2, 12, 13]。因此亲缘关系，本研究对来自北京市房山区‘磨盘柿’产区的系列变异单株进行IRAP分析，以期为明晰其变异性质提供科学依据。
表1 本研究所用20份试材
Table 1 List of 20 Diospyros spp. used in this study
|
编号
Code
|
基因型
Genotype
|
学名
Scientific name
|
来源地
Origin
|
样品采集地
Collection location
|
备注
Note
|
|
1
|
BZDMP
|
Diospyros kaki Thunb.
|
China
|
a
|
‘磨盘柿’标准品
Standard Damopan
|
|
2
|
DMP2
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
3
|
DMP3
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
4
|
DMP4
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
5
|
DMP5
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
6
|
DMP6
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
7
|
DMP7
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
8
|
DMP8
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
9
|
DMP9
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
10
|
DMP10
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
11
|
DMP11
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
12
|
DMP12
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
b
|
‘磨盘柿’芽变
Mutation from Damopan
|
|
13
|
罗田甜柿
Luotian-tianshi
|
D. kaki Thunb.
|
China
|
a
|
|
|
14
|
富有
Fuyuu
|
D. kaki Thunb.
|
Japan
|
a
|
|
|
15
|
松本早生
Matsumoto-wase
|
D. kaki Thunb.
|
Japan
|
a
|
‘富有’芽变
Bud sport from Fuyuu
|
|
16
|
上西早生
Uenishi-wase
|
D. kaki Thunb.
|
Japan
|
a
|
‘松本早生’芽变
Bud sport from Matsumoto-wase
|
|
17
|
次郎
Jirou
|
D. kaki Thunb.
|
Japan
|
a
|
|
|
18
|
前川次郎
Maekawa-Jirou
|
D. kaki Thunb.
|
Japan
|
a
|
‘次郎’芽变
Bud sport from Jirou
|
|
19
|
阳丰
Youhou
|
D. kaki Thunb.
|
Japan
|
a
|
‘富有’ב次郎’
Offspring of Fuyuu×Jirou
|
|
20
|
君迁子
Date plum
|
D. lotus L.
|
China
|
a
|
|
注：a：采自华中农业大学柿圃；b：采自北京房山区张坊镇
Note: a: from Persimmon Repository, Huazhong Agricultural University, Wuhan, China; b: from Zhangfang town, Fangshan District of Beijing, China
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料共20个基因型。包括近缘种君迁子（D.lotus L.）、已知亲子关系的若干试材、‘磨盘柿’标准品种（D.kaki Thunb.‘Mopanshi’）及其11个变异单株。试材采集地及详细信息见表1。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取和质量检测 参考Doyle and Doyle [14]的方法。DNA质量及浓度检测使用Cary-50 紫外分光光度计（美国Varian 公司），终浓度稀释至10 ng/μL，4℃保存备用。
1.2.2 IRAP扩增及产物检测 IRAP操作同杜晓云和罗正荣[15]。逆转座子引物3序列见表2（参考杜晓云等[16] 和Du等[3]），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增产物于2.0％琼脂糖（西班牙Biowest）凝胶电泳检测论文网站大全。SYNGENE凝胶成像系统观察和记录谱带。
1.2.3 扩增谱带统计分析 电泳条带按1/0 形式进行数据转换，只统计清晰、重复性强的条带。扩增产物按同一位点条带有或无分别赋值，有带记为“1”，无带记为“0”；采用NTSYS-pc version 2.1 软件[17]计算Jaccard相似指数亲缘关系，UPGMA（unweighted pair group methodarithmetic averages）法聚类。
表2 本研究所用逆转座子引物序列及特征
Table 2 Retrotransposon primers sequences andcharacteristics used in this study
|
引物
Primersa
|
序列（5’-3’）
Sequence (5’-3’)
|
长度（bp）
Length (bp)
|
退火温度（°C）
Tm (°C)
|
|
rtdk14-f1
|
TTCATTGTCGTGTTTCGTAGGCG
|
23
|
60.2
|
|
rtdk12-f2
|
CATAGGAGGCTGTTGAGCAGAGTG
|
24
|
63.7
|
|
rtdk20-f3
|
CTATCTTGCCTCCTTCTGCTTTC
|
23
|
60.2
|
|
rtdk13-f5
|
CATCATCTGTTACTCTTGTGCTT
|
23
|
59.7
|
|
rtdk15-f6
|
TGAGTGGTGATGTAAGAGAGTA
|
22
|
56.5
|
|
rtdk7-f7
|
GGAGACTTTACTATTGAGCC
|
20
|
58.0
|
|
rtdk16-f8
|
GCTGTCCCCTTCCCCTGTTT
|
20
|
64.0
|
|
rtdk14-r1
|
CATTGGGTCCATCAGTTTCC
|
20
|
57.8
|
|
rtdk13-r5
|
ACAAGAGTAACAGATGATGATTC
|
23
|
55.3
|
|
rtdk13-r6
|
GCATTGGGTCCATCAGTTTC
|
20
|
60.0
|
|
rtdk16-r9
|
CAACACGAAATACGGCTACG
|
20
|
60.0
|
|
rtdk16-r10
|
CTGCGACTTCACCAAGCCATAAA
|
23
|
60.6
|
|
rtdk11-p1
|
GCTTGAGGGGGAGTGTTGAGTT
|
22
|
61.9
|
|
rtdk4-p3
|
GAAGGGAGGTCTAAACTGAGGAAA
|
24
|
60.3
|
|
rtdk10-p4
|
GGTCCATCTTGAGGGGGAGTAA
|
22
|
62.1
|
|
rtdk5-p5
|
TGCTAAGAACAAAATACCTCATAG
|
24
|
57.3
|
|
rtdk2-p6
|
TGAGGGAGGCCTTACTATTGAG
|
22
|
60.3
|
|
rtdk5-p7
|
AACAAAATACCTCATAGAGTGGC
|
23
|
59.3
|
|
rtdk17-p8
|
GAGGGGAAACTCAGTGACTTAGG
|
23
|
62.4
|
注：a：逆转座子引物序列参考杜晓云等[16]和Du等[3]
Note: a: Retrotransposon primers according to Du et al[16] and Du et al [3]
2 结果与分析
2.1 多态性分析
19个逆转座子引物在供试的20份试材中共扩增出123条带，其中51.22％（63条）具多态性。19个引物中，11个无多态性，其它引物多态性介于50.00％～90.00％。利用此11个多态引物可将20份试材全部区分。19个逆转座子引物的详细扩增情况见表3。
供试12份磨盘柿中，19个引物共扩增109条带，多态性带21条，多态比例19.27％。其中，4个引物（rtdk4-p3亲缘关系，rtdk2-p6，rtdk13-f5和rtdk16-r10）具多态性。利用多态引物能很好地对12份‘磨盘柿’基因型鉴别区分（表4）论文网站大全。图1箭头所指为可用于鉴别的特异于某些基因型的谱带。
2.2 相似指数及聚类分析
基于19个引物的123个IRAP标记计算试材间相似指数。作为外类群的柿近缘种君迁子与柿的平均相似指数为0.68；已知亲子关系的‘阳丰’与其母本‘富有’和父本‘次郎’间的平均相似指数分别为0.85和0.87；已知芽变关系的‘前川次郎’（‘次郎’的芽变）和‘次郎’，‘富有’和‘松本早生’（‘富有’的芽变），‘松本早生’和‘上西早生’（‘松本早生’的芽变）、‘富有’和‘上西早生’间的相似指数依次为0.97、0.96、0.90和0.88。11份‘磨盘柿’变异单株间的相似指数在0.90（‘DMP2’与‘DMP4’、‘DMP8’、‘DMP9’）～0.98（‘DMP7’和‘DMP8’）之间，平均0.94，它们与标准品种‘BZDMP’平均相似指数为0.91。可见，供试变异单株与标准品种间的差异可归属于芽变范围。
表3 IRAP引物扩增信息
Table 3 Summary of PCR amplification corresponding toindividual primer in IRAP analysis
|
引物
Primer
|
总带数
Total number of bands
|
多态性带数
The number of polymorphic bands
|
多态性带比例
The percent of polymorphic bands
|
|
rtdk14-f1
|
5
|
0
|
0%
|
|
rtdk12-f2
|
10
|
9
|
90%
|
|
rtdk20-f3
|
3
|
0
|
0%
|
|
rtdk13-f5
|
9
|
7
|
77.78%
|
|
rtdk15-f6
|
5
|
0
|
0%
|
|
rtdk7-f7
|
4
|
0
|
0%
|
|
rtdk16-f8
|
5
|
0
|
0%
|
|
rtdk14-r1
|
7
|
0
|
0%
|
|
rtdk13-r5
|
3
|
0
|
0%
|
|
rtdk13-r6
|
8
|
6
|
75.00%
|
|
rtdk16-r9
|
6
|
4
|
66.67%
|
|
rtdk16-r10
|
8
|
5
|
62.50%
|
|
rtdk11-p1
|
6
|
5
|
83.33%
|
|
rtdk4-p3
|
7
|
5
|
71.43%
|
|
rtdk10-p4
|
2
|
0
|
0%
|
|
rtdk5-p5
|
6
|
3
|
50.00%
|
|
rtdk2-p6
|
10
|
6
|
60.00%
|
|
rtdk5-p7
|
11
|
8
|
72.73%
|
|
rtdk17-p8
|
8
|
5
|
62.50%
|
|
Total
|
123
|
63
|
51.22%
|
|
Average
|
7
|
4
|
|
图1 4个引物在12份磨盘柿基因型中的IRAP扩增电泳图谱
A: rtdk4-p3; B: rtdk2-p6; C: rtdk13-f5; D: rtdk16-r10
M：DL2000marker; 1. BZMP；2～12. MP2～MP12。黑色箭头表示特异于某一基因型的条带
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