论文摘要：以陇东马牙枣盛花后50～60d的幼胚为试材，采用三步培养法诱导胚状体。第一步先将去皮种子接种在胚萌动培养基上；第二步当胚萌发后从胚乳中或愈伤组织中剥离转至MS无激素的培养基上培养，30d后转接至诱导愈伤组织培养基上诱导愈伤组织；第三步由愈伤组织诱导胚状体成苗。试验结果表明：诱导愈伤组织适宜的培养基为Nitsch培养基上附加BA 1.0 mg.L +2，4-D1.5 mg.L +蔗糖30 g.L +琼脂4.0 g.L 。诱导胚状体培养基宜选用，MS+BA1.0 mg.L + IBA0.2 mg.L +LH0.5 mg.L +Vc0.1 mg.L +蔗糖30 g.L +琼脂4.0 g.L ，并获得再生植株。
论文关键词：枣,愈伤组织,胚状体
枣的胚败育问题严重制约着枣杂交育种进程，以幼胚为外植体诱导愈伤组织获得再生植株可以解决胚败育问题，并且愈伤组织再生系统的建立是细胞培养、原生质体培养、细胞融合及遗传转化等研究获得成功和应用的基础（何业华等，1998）。由愈伤组织诱导胚状体可以培育人工种子、简化育种程序及其与基因工程、脱病毒等生物技术相结合诸方面,具有诱人的前景（王雅梅等，2008）。利用枣幼胚获得胚状体及再生植株的报道仅见六月鲜枣（李登科等，2004）。本研究以陇东马牙枣盛花后50～60d的幼胚为试材，进行愈伤组织和胚状体的诱导，最终获得再生植株，为枣新品种的选育提供育种基础。
1材料和方法
陇东马牙枣取自甘肃省农科院果树所枣品种园，陇东马牙枣生育期180天左右，果实生长期120天左右。陇东马牙枣2005年盛花期为6月18日，根据预备实验的结果，采样时间为2005年8月上旬枣盛花后50～60d的幼胚。首先将枣果放入烧杯，加入洗衣粉清洗枣果表面赃物，然后用流水冲洗1～2h，切开果肉与果核（果核没有达到硬核期，70%发育至心形胚时期，陇东马牙枣自然含仁率在60%），剥出种子（图版1），用流水冲洗1～2h后置于超净工作台上用75%乙醇消毒2min，再用0.1%HgCl消毒8min，最后用无菌水冲洗3～5次，剥去种皮后接种于培养基上。经10d后观察萌发率，去除污染株。培养条件为：室温22℃。培养间温度26℃～28℃，光照度2000～3000Lx，光照时间12h/d。
采用三步培养法。第一步先将去皮种子（图版2）接种在MS-H（曹孜义，2002）+ZT0.5mg.L+IAA0.6mg.L+蔗糖50g.L+LH0.5g.L+琼脂4.0g.L+PVP0.2g.L幼胚萌动培养基上获得47.62%的幼胚萌发率（张存智,王发林等，2008）。
第二步当胚萌发后，将萌发的幼胚从胚乳中或愈伤组织中剥离转至无激素的MS培养基,培养30天后分别转移至MS（改良）即大量元素减半和Nitsch（曹孜义，2002）基本培养基上，都附加BA1.0mg.L+2，4-D1.5mg.L+蔗糖30g.L+琼脂4.0g.L诱导愈伤组织培养基上，诱导愈伤组织；
第三步由愈伤组织诱导胚状体成苗（其培养基设计见表1）。
表1愈伤组织诱导胚状体培养基
Table1MediumcompositionSomaticembryoinductionfromcallus
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组合
Cross
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基本培养基
Basic medium
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IBA
（mg.L ）
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BA
（mg.L ）
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1
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MS
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0.5
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0
|
|
2
|
MS
|
0.2
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1.0
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|
3
|
MS改良
|
0.5
|
1.0
|
|
4
|
MS改良
|
0.2
|
0
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2结果与分析
2.1枣幼胚诱导愈伤组织
结果表明：外植体接种在MS-H+ZT0.5mg/L+IAA0.6mg/L+蔗糖50g/L+LH0.5g/L+琼脂4.0g/L+PVP0.2g/L幼胚萌动培养基上，10d后胚陆续变绿，有些外植体20d后胚乳开始肿胀，长出乳白色(有的略带淡黄色)初生愈伤组织（图版3），30d后愈伤组织增生。将变绿的幼胚从胚乳中或愈伤组织中剥出（胚与胚乳易于分离）接种在无激素的MS培养基上，培养30d后，子叶展开，增大,长出胚根的子叶胚（图版4）；但不能继续发育成叶色浓绿、根、茎齐全的正常的幼苗。将子叶展开，增大，长出胚根的子叶胚分别接种在愈伤组织诱导培养基MS（改良）即MS培养基大量元素减半、Nitsch培养基上，附加BA1.0mg/L+2，4-D1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.0g/L诱导愈伤组织。30d后观察记录结果，比较基本培养基诱导愈伤组织的效果（表2）。结果表明，两种培养基上都诱导出两种类型的愈伤组织，Ⅰ型愈伤组织呈黄绿色，组织致密，（图版5）；Ⅱ型愈伤组织黄褐色、黑褐色（图版6）。但不同类型的愈伤组织在不同培养基上产生的比例不同，Nitsch黑褐率较高，而1/2MS黄绿色率较高。
表2基本培养基诱导愈伤组织的效果
Table2Effectofbasicalmediumoninductionrateofcallus
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基本培养基
Basic
medium
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接种个数
No.of expand
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愈伤诱导率(%)
Induction
Rate of callus
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愈伤生长量
Callus yield
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愈伤质地
Callus
quality
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愈伤颜色Callus color
黄绿率(%) 黑褐率(%)
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Yellow and Black and
Green rate brown rate
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MS（改良）
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42
|
95
|
++++
|
**
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83
|
17
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Nitsch
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38
|
97
|
++++
|
**
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50
|
50
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备注：++++：生长旺盛;**：生长致密Note：++++：growvigorously；**：growcompactly
从表2可以看出Nitsch、MS（改良）培养基的出愈率都较高，两类培养基的愈伤组织的生长量都非常旺盛。Nitsch、MS（改良）即MS培养基大量素减半培养属于低盐培养基，这证明枣高效愈伤组织诱导适宜在低盐培养基上进行，这和李登科（李登科等，2004）利用枣的嫩茎、幼叶、花药和胚乳诱导愈伤组织的对基本培养基的筛选结论是一样的。
2.2胚状体诱导及再生
将子叶展开，增大,长出胚根的子叶胚产生的愈伤组织转移到1~4号（表1）培养基中每45d继代一次，2次后可见大量的胚状体发生（图版7）。胚状体在MS+BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+LH0.5mg/L+Vc0.1mg/L+蔗糖30g/L上继代两次，发育成具有根、茎、叶的正常植株（图版9），具有子叶和胚根，与胚直接成苗相似（图10）(张存智等2008)。 1/2 1 2 下一页 尾页 |
