论文导读:：本文将主要讨论BAC-FISH技术的原理。比较作图研究。功能基因定位。
关键词：BAC-FISH，染色体核型分析，比较作图，基因定位
原位杂交技术是一项利用标记的DNA或者RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。它的产生标志着传统的细胞遗传学技术向现代分子遗传学技术的转变。原位杂交技术自从产生以来，得到了长足的发展。从放射性标记到荧光标记；从单探针到多探针；染色体的制备也从传统的中期染色体、粗线期染色体，再到DNA纤维，原位杂交技术在其检测的精确度和灵敏度上得到了极大地提高。但是，由于受到信号检测能力的限制，传统原位杂交技术中运用最多的还是5S和45S rDNA、端粒以及着丝粒等区域的串联重复序列，单拷贝或低拷贝小片段在原位杂交中很难检测到。
细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH) 是以细菌人工染色体(BAC) 克隆作为探针进行的染色体原位杂交，由于克隆的外源片段一般为100 kb以上，其探针与靶DNA序列相遇的机会大，杂交信号检出率大大提高。因此，它较单拷贝或低拷贝小片段DNA序列杂交更为容易，而且准确可靠，从根本上克服了过去单拷贝DNA杂交的困难论文网，大大促进植物尤其是二倍体物种基因组的研究，现已成为植物核型分析、基因定位及物理图谱构建等分子细胞遗传学研究的有力工具。本文将主要讨论BAC-FISH技术的原理，在植物基因研究中取得的重要成果以及新的发展方向。
1 BAC-FISH技术的原理和优势
BAC-FISH中应用的BAC探针主要有两种。第一种是含有染色体特异的散布式重复序列的BAC片段。以一个或多个这样的BAC片段作为探针，其信号能够覆盖整条染色体，所以该方法又称之为染色体涂染（chromosome painting）[1]。染色体涂染技术最早来自于哺乳动物细胞遗传学研究，由Pinkel 等人建立，并用于检测人类21号染色体的三体细胞[2]。目前在哺乳动物、鸟类及爬行动物染色体的研究中应用十分广泛。染色体特异的散布式重复序列是哺乳动物基因组的一大特点，通过流式细胞仪或显微切割技术获得含有染色体专一性重复序列的BAC片段，以这些BAC作为探针能够在细胞核中鉴定出不同的染色体。探针中含有的少量共有序列，可以在杂交前或杂交时通过加入过量的基因组DNA封阻掉。与动物基因组不同，植物中的散布式重复序列往往分布于整个基因组的不同染色体上[3, 4]。这些序列在杂交过程中很难被封阻，从而使得染色体涂色染技术在植物中很难实现[5, 6]，目前仅在拟南芥及其近缘源物种中得到成功应用[7, 8]。
BAC-FISH中使用的另一种探针是，含有单拷贝序列的染色体特异性BAC。利用分布于同一染色体上的一个或者多个含有单拷贝序列的BAC片段对染色体进行杂交。通过杂交信号在染色体上的分布进行染色体识别，以及结构和变异的研究[9]。尽管这些探针的信号不能覆盖整条染色体，但是包含其中任何一个探针的染色体重组都是能够被检测到的，片段丢失和重复也能够通过信号数量的变化检测到。这种染色体特异的单拷贝BAC片段是BAC-FISH技术在植物中使用的主要探针类型。利用该技术，已经在植物中揭示了许多重要的染色体进化事件，包括首次在植物中检测到的着丝粒重排事件[10]。在使用BAC制备探针的过程中，含有着丝粒等染色体共有重复序列区域的BAC必须去除掉，因为它们会在多个不同的染色体上产生杂交信号。此外，在杂交过程中，该基因组的Cot-1 DNA也往往被用作封阻对基因组DNA进行竞争性杂交。Cot-1 DNA仅仅含有高度和中度重复序列，在杂交过程中可以有效封阻掉探针中的重复序列，从而避免探针中重复序列与染色体产生非特异性杂交。
与其它的原位杂交探针相比，染色体专一性BAC探针具有以下优势。首先，针对每一条染色体的探针都是特异的论文网，这样就极大地提高了鉴定的准确性。其次，该技术对染色体制备的要求不高，可以检测几乎所有分裂周期中的染色体，甚至染色体片段[9]。在染色体较小的情况下，多个杂交信号往往会互相干扰甚至重叠，而BAC-FISH技术对每一条染色体的探针都是专一性的，不依赖与杂交信号在染色体上的分布模式，所以该技术尤其适合用于小染色体植物[9, 11-17]。
2 BAC-FISH在植物染色体研究中的应用
2.1染色体识别及核型研究
染色体的正确识别是进行细胞遗传学研究的基础。基于FISH的染色体识别技术，不依赖于染色体的凝缩程度或者臂比的测量，可以在细胞分裂的所有时期将染色体鉴定出来，从而可以研究整个细胞周期中，染色体的行为以及在细胞核中的空间分布[18, 19]。核型研究中运用最多的是5S和45S rDNA、端粒以及着丝粒等区域的串联重复序列[9, 20-23]。这些重复序列在基因组内往往会有多个杂交位点，根据这些信号位点在不同染色体上的分布模式，我们可以区分开同一细胞核中不同的染色体[24, 25, 26]。利用重复序列探针鉴定染色体存在的一个问题是，杂交信号在同一个物种的不同个体间会存在差异，从而会影响我们从不同个体中识别出相同的染色体。此外，局限于杂交位点以及探针种类的限制，特别是当不同的染色体表现出相近的杂交模式时，这种方法就难以对非同源染色体进行准确的区分[9]。
BAC-FISH技术利用染色体专一性BAC片段作为探针，探针信号在染色体上的分布是唯一的，从而可以避免传统原位杂交技术在染色体识别上的困难。BAC-FISH技术首先在水稻、拟南芥等模式植物中取得了成功，目前已经成功地应用到了许多植物染色体鉴定与核型分析的研究中。在水稻中，单个的BAC序列早在1995年就被成功定位到了相应的染色体上[27]。随后，Cheng等人利用24个染色体臂专一性的BAC克隆，成功地区分出了水稻的12对染色体上，并结合已有的着丝粒探针，建立起了一个标准的水稻染色体核型[28]。这些探针还被成功应用到了同属的其它野生稻物种中论文网，说明染色体专一性BAC片段在近缘物种中具有较强的通用性[17]。除此之外，BAC-FISH技术也被成功地用于其它玉米、高粱、小麦等禾本科植物的染色体的鉴定与核型研究中[15, 29-31] [4, 32]。
拟南芥基因组较小，含有的散布式重复序列相对较少，因此它是目前唯一一种成功应用染色体涂染技术的植物。Lysak等人将139个BAC序列混合作为探针，成功地标记出了4号染色体的全部区域。这些探针在能在减数分裂的所有时期识别出4号染色体或者其分布区域[7]。利用多色荧光原位杂交技术，他们进一步鉴定出了拟南芥的所有5对染色体[8, 33]。
随着越来越多的植物BAC序列文库的构建，大量的BAC片段被定位到同一条染色体上，从而构建出越来越详细的染色体核型[34-36]。减数分裂粗线期染色体通常是有丝分裂中期染色体的10-20倍，适用于高分辨率的BAC-FISH作图，能够清晰地显示染色体的形态、结构以及探针的位置[37, 38]。Iovene等人将30个在遗传图谱上定位的BAC片段成功杂交到了马铃薯粗线期的6号染色体[35]。FISH的结果清晰地显示了着丝粒及近着丝粒的异染色质区的位置。最近，Tang等人通过多色荧光原位杂交技术，将60个在RFLP遗传图谱上定位的BAC片段作为探针，成功地在粗线期鉴定出了马铃薯的全部12对染色体[39]。平均每条染色体分布有5个BAC片段，这些探针主要分布于染色体的常染色质区，与它们在遗传图谱上相对应的位置。通过建立这样一个基因组范围的细胞遗传学图谱，得到了一个详细可靠的马铃薯粗线期染色体核型，并将遗传图谱和物理图谱信息结合到了一起。
棉属多倍体植物，由于大量重复序列的存在使得筛选到合适的BAC片度较为困难。此外，棉花染色体较小而多，细胞质浓厚且容易覆盖在染色体上，因而难以获得易于进行原位杂交的染色体制片。研究人员通过选择棉花分子遗传图谱中高重组区的微卫星位点(simple sequence repeats，SSR) 标记的策略，筛选到不含或含有少量重复序列的细菌人工染色体(BAC) 克隆；同时，在通用FISH 技术程序基础上，通过改进发生根、变性、洗脱条件等步骤, 构建出适合于棉花的BAC-FISH 技术，简化了操作流程的同时，获得稳定的杂交结果及较高的检出率；并通过将一随机获得的BAC 进行染色体的物理定位论文网，进一步引入双探针、双色及重复杂交技术，成功地将BAC-FISH技术引入到棉属植物染色体研究中[40]。通过该技术他们首先筛选到7个可以用于BAC-FISH的探针，并成功地鉴定出了多倍体中相应的染色体[41]。通过进一步筛选，成功地鉴定出了四倍体棉花全部的26对染色体[42]。这些BAC探针可以准确地将每条染色体对应到相应的连锁群。比较这26个BAC片段在染上的位置，发现他们都位于染色体的末端或近末端。由于这些BAC片段与遗传连锁图谱上的标记相对应，所以说明棉属植物的染色体交换主要发生在染色体末端区域。通过将于遗传图谱相对应的BAC片段在染色体上的定位，将有助于我们评估遗传图谱标记对染色体的覆盖程度，从而推动棉属植物的基因组研究。
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