| CK，为无菌水接种；WB为纯培养细菌接种。白色箭头标明针刺接种部位。
Fig.12Pathogenicityassayofisolatedpathogenfromwalnutblightdiseasedbranchsticks.Typicalsymptominducedinwalnutinoculatedleavesf(A)andbranches(B)inoculatedwithisolatedbacterium(A)andsticks(B).CK,,inoculatedleaforstickwithdistilledwater;WB,,inoculatedleaforstickwiththeisolatedbacteria.
图23核桃黑斑病菌总DNA提取和16SrDNA的PCR扩增结果
（A）核桃黑斑病菌总DNA电泳图；（B）核桃黑斑病菌16SrDNA的PCR扩增结果电泳图。M1为λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ双切Marker，M2为DNAplus2kMarker，WB为核桃黑斑病菌，CK为无菌水对照
Fig.23TotalDNA(A)andPCRamplificationof16SrDNAfragment(B)fromisolatedbacteriathatinfectwalnut.M1,,λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker;M2,,DNAplus2kMarker;WB,,isolatedbacteria;CK,,distilledwater
图3重组质粒重组质粒电泳图
M为DNAplus2k分子量标准，1-4：为随机挑取的4个大肠杆菌菌落的质粒,T为pMD-18T空载体对照
Fig.3Electrophoresisanalysisofrecombinantplasmid,MrepresentTrans2kplusDNAMaker,1-4：plasmidofthe4randomlyselectedE.coilcolony（A）,T:pMD-18Tvector
表1黄单胞属成员及典型株系16SrDNA序列的GenBank登录号
Tab.1Xanthomonasstrainsandaccessionnumbersoftheir16SrDNAgenesequences
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黄单胞属成员Taxon
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典型株系GenBank登录号
Type strains’ accession no.
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X.arboricola
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Y10757
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X.albilineans
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X95918
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X.axonopodis pv. axonopodis
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X95919
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X.bromi
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Y10764
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X.campestris pv. campestris
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X95917
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X.cassavae
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Y10762
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X.codiaei
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Y10765
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X.cucurbitae
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y10760
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X.fragariae
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X95920
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X.hortorum
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Y10759
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X.hyacinthi
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Y10754
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X.melonis
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Y10756
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X.oryzae pv. oryzae
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X95921
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X.pisi
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Y10758
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X.populi
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X95922
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X.sacchari
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Y10766
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X.theicola
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Y10763
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X.translucens pv. translucens
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X99299
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X.vasicola pv. holcicola
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Y10755
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X.vesicatoria
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y10761
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3讨论
 
图4核桃黑斑病菌北京株系（WB-Beijing）16SrDNA系统发育树分析
树枝发育树分枝上的标的数字代表bootstrap值，括号中注明黄单胞杆菌属成员16SrDNA在GenbBank中的登录号
Fig.4Phylogenetictreeobtainedfromthealignmentof16SrDNAsequencesofWB-BeijingandXanthomonastypestrains
Thenumbersbesidethebranchrepresentthevalueofthebootstrap,,，thecodesinthebracketsrepresenttheaccessionnumbersofXanthomonasstrains’16SrDNAsequences
3讨论
我国关于核桃黑斑病发生和防治的研究目前限于病菌的分离和防治试验。为进一步明确我国核桃黑斑病病原菌的分类地位，我们在研究中首先分离纯化了病原菌并进行了致病性实验，完成柯赫氏法则验证，然后提取核桃黑斑病病原细菌的总DNA，利用细菌16SrDNA的通用引物，采用PCR的方法扩增并克隆了核桃黑斑病菌的16SrDNA序列，测定了北京发生的核桃黑斑病病原菌16SrDNA序列，为从分子上进行病原菌鉴定和分类提供了数据。
在采用组织分离法进行病菌初分离过程中，得到性状单一的菌落，经单菌落纯化培养后，培养形性状与文献报道一致，说明该病原菌在病斑中的浓度非常高，成为优势菌群。经在核桃幼嫩叶片和枝条上进行病原菌回接实验，产生了典型症状的病斑，确认了分离纯化的细菌的致病性；然后又采用组织分离法从回接实验产生的病斑上分离细菌，得到了多种性状的菌落，其中一些菌落表现典型核桃黑斑病菌的典型形性状，经测定16SrDNA序列，获得了与回接菌一致的序列，完成了柯赫氏法则工作，证明了分离纯化的病菌能够引起核桃黑斑病。
国际上关于核桃黑斑病菌的命名尚有争论，最早被官方公认的名称为X.campestrispv.juglandis(Pierce)Dye(Dyeetal.,,1980)，后来又被命名为X.arboricolapv.juglandis（Pierce）Vauterinetal.(Vauterinetal.,,1995)，最近有提议将X.arboricola更换为X.juglandis(Pierce)Dowson(Schaadetal.,,2000)。 3/4 首页 上一页 1 2 3 4 下一页 尾页 |
