论文导读:：而同样采用绝迹稀释法原理制备的测试瓶法制作简单。考察细菌总数指标。者对于现场取样的景观水体均存在不能在野外现场进行快速检测的缺点。
论文关键词：测试瓶法，细菌总数，景观水
景观水常规水质检测指标主要包括CODCr、NH3-N、TP、BOD、叶绿素-a、浊度、透明度、水温、细菌总数等多项。微生物指标能够显示水体的不同污染程度，在水体修复过程中有重要参考价值。本试验以景观河道等水样为主要检测对象，考察细菌总数指标，选取合适的分析方法，并在一定程度上反映受污染水体在生物修复过程中微生物的含量变化。
目前细菌总数的主要测定方法有平皿计数法、最可几率法（MPN）、光学显微镜计数法、荧光显微镜计数法、浑浊度计数法、电阻抗法等[1]。其中成本较低且广泛应用于水中细菌总数测定的为平皿计数法和MPN法。平皿计数法操作繁琐，全程需无菌条件，环境及人为因素对测定结果影响较大；MPN法操作相对简便，二者对于现场取样的景观水体均存在不能在野外现场进行快速检测的缺点。而同样采用绝迹稀释法原理制备的测试瓶法制作简单，携带方便，能够于取样现场操作。测试瓶可提前数天大量制备，随时取用生物论文，避免了一般测试方法冗长的准备时间。该法原用于石油天然气行业标准中的油田注入水细菌分析（SY/T 0532-93），已经有文献报道，采用不同培养基制成的针对冷却水中硫酸盐还原菌[2]、铁细菌[3]，以及产表面活性剂菌[4]、黄原胶降解菌[5]等不同菌种的测试瓶，经验证与MPN法测定结果完全或接近一致。
1 试验方法
1.1 测试瓶的制备
在水体表层光线穿透的地方存活有藻类和光合细菌，制造氧气，因此有氧浅水层生活着大量的好氧细菌，氧气浓度较低的水层主要是兼氧细菌，只有在深水层和底泥中有各种厌氧细菌。河道、湖泊等景观水取样时一般在表层深约0.3-0.5 m处，主要含好氧细菌，培养基的选择以培养好氧菌为主免费论文。
参考平皿计数法中培养细菌所用的牛肉膏蛋白胨培养基[6]，除去起固化作用的琼脂组分制成液态培养基。由于没有一种单独的培养基能够满足某一水样中所有种类细菌生长所需的生理条件，因此该培养基培养所测得的细菌总数实际上要小于被测水样中真正存在的细菌数目，且培养获得的应为活菌总数。
取牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，用10% NaOH 调整pH至7.0-7.2，溶于1000 mL水中，若有浑浊可过滤。选取容量约12 mL的细菌培养瓶，用定量加液器注入9 mL液体培养基，橡胶盖铝箔密封后在121±1℃下灭菌半小时。
1.2 测试方法
粗略估计待测样的细菌总数，选取合适的测试瓶数量并编号，可同时测定平行样。用无菌注射器取1 mL待测样生物论文，注入1号瓶，摇匀得1:10稀释浓度；另取一支无菌注射器从1号瓶内取1 mL液体注入2号瓶，摇匀得1:100稀释浓度；取第三支无菌注射器从2号瓶内取1 mL液体注入3号瓶，摇匀得1:1000稀释浓度，以此类推，根据需要而重复取样稀释过程。将培养瓶置于37℃恒温培养箱内培养。
图1 测试瓶法示意图
Fig.1 Test-bottle Schematic
培养完毕后观察，培养液成云状浑浊则表示有细菌生成。1号瓶有细菌生成则细菌总数为1-10个/mL；2号瓶有细菌生成则细菌总数为10-102个/mL。直至第n个测试瓶出现浑浊，而第n+1个测试瓶中培养基仍保持澄清状态，则细菌总数为10n-1-10n个/mL，由此可得样品中最大可能细菌总数。若要得到更准确的结果，可进行平行试验，以相应的数量指标查计数统计表[7, 8]得到细菌总数的近似值。
2 测试结果分析
2.1测试瓶法培养时间的确定
平皿计数法中细菌培养时间为37℃恒温下24 h，MPN法及文献报道的测试瓶法中根据测试菌种的不同而确定7-15d的培养时间。选取4组不同水样，每组6个不同稀释度，每天观察每组样品中出现浑浊的测试瓶个数，直至结果保持稳定。
由表1可知，接种后的1-2 d，细菌处于生长阶段，第3天直至第7天内不再有新的测试瓶出现浑浊现象，即细菌总数不再发生变化，故可认为培养时间为1-2 d。在实际操作中，相比于其他需要数天长期培养观察的方法大幅度缩短时间，更适宜于实际应用生物论文，可更好的针对现象及时采取处理措施，获得最佳效果。
表1 培养时间分析结果
Tab.1 Culture Time Analysis
|
试验序号
|
出现浑浊的测试瓶数/个
|
稳定期/d
|
|
1 d
|
2 d
|
3 d
|
4 d
|
5 d
|
6 d
|
7 d
|
|
1
|
4
|
5
|
5
|
5
|
5
|
5
|
5
|
2
|
|
2
|
4
|
5
|
5
|
5
|
5
|
5
|
5
|
2
|
|
3
|
2
|
4
|
4
|
4
|
4
|
4
|
4
|
2
|
|
4
|
3
|
3
|
3
|
3
|
3
|
3
|
3
|
1
|
2.2 两种方法测试结果比较
本试验同时采用平皿计数法和测试瓶法对不同取样点的校园景观河道河水进行测试。一般景观水中的细菌总数含量均较高，基本上＞100个/mL，故采用多个稀释度，两种方法的测试结果分别见表2、表3。
表2 平皿计数法试验结果
Tab.2 Experimental Results of Plate Count Method
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试验序号
|
不同稀释度的平均菌落数/个
|
细菌总数
/个·mL-1
|
|
10-1
|
10-2
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
|
水样1
|
277
|
41
|
17
|
1
|
—
|
3.4×103
|
|
水样2
|
无法计数
|
393
|
20
|
6
|
—
|
2.0×104
|
|
水样3
|
164
|
20
|
1
|
—
|
—
|
1.6×103
|
|
水样4
|
215
|
33
|
3
|
—
|
—
|
2.7×103
|
表3 测试瓶法（三管平行）试验结果
Tab.3 Experimental Results of Test-bottle(three timesparallel)
|
试验
序号
|
不同稀释度的长菌瓶数/个
|
数量指标
|
细菌总数
/个·mL-1
|
|
10-1
|
10-2
|
10-3
|
10-4
|
10-5
|
10-6
|
|
水样1
|
3
|
3
|
2
|
2
|
1
|
0
|
323
|
3.0×103
|
|
水样2
|
3
|
3
|
3
|
2
|
2
|
0
|
322
|
2.0×104
|
|
水样3
|
3
|
3
|
2
|
1
|
0
|
0
|
321
|
1.5×103
|
|
水样4
|
3
|
3
|
3
|
0
|
0
|
0
|
300
|
2.5×103
|
表3中数量指标的确定可参考MPN法测定细菌总数时的计数统计表，见郑平主编的《环境微生物学实验指导》、俞毓馨主编的《环境工程微生物检验手册》等。
由表4可知，两种测试方法在数量级上保持一致，平皿计数法所测得的细菌总数相对测试瓶法的测试结果要高，相对误差基本上可控制在10%左右。细菌总数的测定受到外界影响因素较大，人为操作不当或器皿灭菌不彻底等皆可导致检测结果有出入。因此，测试瓶法可代替或部分代替平皿计数法在野外现场快速检测水体中细菌总数。
表4 平皿计数法与测试瓶法结果比较
Tab.4 Test Results Comparison of Plate Count Method andTest-bottle
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试验序号
|
细菌总数/个·mL-1
|
相对误差%
（以平皿计数法计）
|
|
平皿计数法
|
测试瓶法
|
|
水样1
|
3.1×103
|
3.0×103
|
-11.76
|
|
水样2
|
2.0×104
|
2.0×104
|
0
|
|
水样3
|
1.6×103
|
1.5×103
|
-6.25
|
|
水样4
|
2.7×103
|
2.5×103
|
-7.41
|
2.3 测试实例
用测试瓶法对采用生物激活剂修复中的受污染水体进行连续测定，考察细菌总数在一定时间范围内的变化，侧面反映水体水质情况免费论文。生物激活剂为一种生物制剂，旨在促进受污染水体中土著微生物的生长，进而加快降解污染物的进程，改善水体水质。在投加药剂的初期，微生物受到刺激数量会相对增长，有效降解有机物，从生物修复的角度改善水体水质和环境。考虑到在水体修复过程中主要考察的是微生物数量上的大致变化和检测的及时性，对其准确性要求一般，故表5中数据均为单瓶测定，所得为最大可能细菌总数值。从表中可得知，在水体修复过程中微生物数量级上有不同程度的增加生物论文，可能有利于对水体中污染物的降解和消除，在水体修复后期可恢复正常。若需获得更准确的数值则可采用多组试验。测试瓶法亦可用于其他药剂如杀菌剂等的快速评价等。
表5 水体细菌总数变化
Tab.5 Variation of Total Bacterial Count in Water
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水样
|
细菌总数/个·mL-1
|
|
水样1
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水样2
|
水样3
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|
修复前
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104
|
103
|
103
|
|
修复中
|
105
|
104
|
105
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3 结论
采用牛肉膏蛋白胨培养基制成的测试瓶，可提前大量制备，测试时无需全程保持无菌，能够缩短试验时间、简化操作条件和步骤，节省检测消耗的资源和人工工作量。可在水体野外现场进行操作，无需采样保存，避免水样的污染和变质，检测及时，达到现场检测快速、简化、低耗等效果。细菌培养条件为37℃恒温下1-2 d。一般景观水细菌含量较高，经试验室试验比较发现平皿计数法与测试瓶法相对误差在10%左右，测试瓶法所得数值相对较低，基本可用测试瓶法代替或部分代替平皿计数法检测景观水体中细菌总数。在对测试结果的精确度要求不高的情况下，可直接采用一组测试瓶测定，获得最大可能的细菌总数，并可连续观察其数量级的变化。
参考文献
[1]王婷婷,邓天龙,廖梦霞.水生细菌计数方法研究进展及展望[J].世界科技研究与发展, 2008, 30(2): 138-142.
[2]何世梅,田剑临,余伟民,等.测试瓶法快速检测循环水中硫酸盐还原菌[J].工业水处理, 2004, 24(1): 52-53.
[3]何世梅,曹立群,田剑临,等.测试瓶法测定循环水中的铁细菌[J].中国给水排水, 2003, 19(11): 98-99.
[4]易绍金,邓勇.细菌瓶法用于产表面活性剂菌菌数测定[J].油田化学, 2005, 22(3): 262-264.
[5]易绍金,熊汉辉.细菌瓶法用于黄原胶降解菌菌数测定[J].油田化学, 2005, 22(2): 192-194.
[6]苑宝玲,李云琴.环境工程微生物学实验[M].化学工业出版社, 2006, 126.
[7]郑平.环境微生物学实验指导[M]. 浙江大学出版社, 2005, 40-44.
[8]俞毓馨.环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990, 140-142.
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