| 对于叶片的接种，用一次性无菌注射器吸取菌液直接穿刺进行接种。
待接种部位表现典型症状后，取病组织再分离病原菌，并测定其形态特征和16SrDNA序列。
1.4病原菌16s16SrDNA的PCR扩增
细菌总DNA提取用中科瑞泰细菌总DNA提取试剂盒按照说明书进行。
以细菌总DNA为模板，用细菌16SrDNA通用引物8F/1522R（正向：5’-TTGATCCTGGCTCAG-3’；反向：5’-AGGTGATCCAGCCGCA-3’）进行PCR扩增。反应体系（25μL）为：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs0.5μL，正反向引物各1μL，DNA模板（细菌总DNA稀释10倍）1μL，Taq酶0.3μL，ddHO18.7μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火1min，72℃延伸1min30s，35个循环，最后72℃延伸7min。
1.5细菌16SrDNA的克隆、测序和分析
将PCR产物电泳分离后，紫外灯下切下目标条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对16SrDNA片段的PCR产物进行回收。将回收产物连接到克隆载体pMD-18T，转化大肠杆菌DH5α，经酶切和PCR验证，获得带有插入片段的阳性克隆。
16SrDNA的测序工作由北京三博远志生物技术公司完成。
使用DNAMANCLASTAL软件对GenBank中登录的黄单胞属细菌成员典型株系的16SrDNA序列和（表1）与测序获得的核桃黑斑病北京株系（WB-Beijing）16SrDNA序列进行位置对齐后，用MEGA5.0软件构建Neighborhood-joining系统发育树分析。
2结果与分析
2.1北京地区发生的核桃黑斑病病原菌的分离、纯化和致病性检测
经组织分离法分离，2天48h后（或多少小时后）在LB培养基上出现淡黄色、光滑、凸起的菌落。（初分离没有得不得到其他性状的菌落，由于菌的浓度高，菌落大部分连成片，只获得少量单的圆形的单菌落，划线纯化后得到典型菌落，性状如下述）。（描述菌落形态）。取105个单菌落划线培养，在表现典型症状的幼嫩枝条上分离到的典型细菌菌落，在LB培养基上培养2天后5个平板的菌落性状一致，菌落为圆形，淡黄色，表面光滑，凸起，4天后为柠檬黄色（图1）。请小陈查记录本，划线后多长时间出现菌落，当时取了几个进行划线培养？
将纯化的菌落活化培养后，在核桃幼嫩叶片和枝条上进行病原菌回接实验以确认致病性。14天后接种的核桃叶片叶脉附近出现黑色多角病斑（图1A2A），接种的枝条产生长条状的褐色凹陷病斑（图1B2B）；，无菌水对照组的叶片和枝条没有症状无菌水对照接种叶片仅有针刺孔，没有病斑；无菌水对照接种的枝条仅在针刺部位有轻微坏死，不扩展也不发生凹陷（图12）。回接实验这表明分离的病原菌具有致病性，侵染核桃树叶片和枝条引起核桃黑斑病典型症状，与自然状态下发生的核桃黑斑病症状一致。
为完成柯赫氏法则，取接种后发病的枝条和叶片，用组织分离法再次分离病原菌，在LB固体平板上得到的菌落特征与接种菌一致。
2.2细菌总DNA提取和16SrDNA片段的PCR扩增、克隆
收集活化培养后的细菌，利用DNA提取试剂盒提取细菌总DNA（图2A3A）。以细菌总DNA为模板，利用细菌16SrDNA通用引物8F/1522R扩增得到PCR产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增产物分子量大小与预期一致，约为1.5Kb（图2B3B）。
将PCR产物纯化后，连接到pMD-18T载体，转化大肠杆菌后，提取质粒。酶切电泳分析表明有4个菌落的质粒比pMD-18T载体对照的分子量大1.5Kb左右（图3A）。表明成功克隆核桃黑斑病菌的16SrDNA片段。
2.3核桃黑斑病菌16SrDNA的全序列测定和分析
将克隆的核桃黑斑病菌16SrDNA片段测序，结果表明该菌株16SrDNA由1453个核苷酸组成。其序列在GenBank中进行BLAST比对分析，结果显示与Xanthomonascampestris及X.arboricola的一些致病变种的相似性为99%。系统发育树分析结果表明WB-Beijing与X.populi、X.campestris、X.vesicatoria、X.theicola、X.Cucurbitae的典型株系进化关系较近（图4）。
图1核桃黑斑病菌在LB平板上培养4天后的菌落形态
Fig.1Themorphologyofwalnutblightbacteria’scolonyafter4day’scultureonLBmedium
图12分离纯化的核桃黑斑病菌致病性测定
（A）（A）纯培养物接种到健康叶片上14天后表现坏死症状；（B）纯培养物接种到健康枝条上14天后的症状。 2/4 首页 上一页 1 2 3 4 下一页 尾页 |
