论文导读：培养基：选用典型的光合细菌生长培养基。试剂：2,4,6-TCP为分析纯(98%)。光照度：4800Lx。研究其对2,4,6-三氯苯酚的降解能力。降解动力学分析。降解动力学，光合细菌对2,4,6-三氯苯酚的降解特性研究。
关键词：光合细菌，生物降解，2，4，6-三氯苯酚，降解动力学
氯酚类化合物(CPs)广泛存在于石油化工、农药、涂料、造纸等行业的废水中，这些废水若直接排放则会造成严重的环境危害。由于酚环结构和氯代原子的存在，氯酚类化合物具有很强的毒性和抗降解能力，大多具有“三致”作用，且容易通过食物链在生物体内富集，严重地威胁着自然生态与人类健康[1]。2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)由于其酚环结构上连有三个氯原子而成为毒性最大的氯酚类化合物之一，已被美国环境保护局(EPA)列为“优先控制污染物”；我国也将其列入68种优先污染物的“黑名单”[2]。
目前，去除废水中氯酚类化合物的方法主要有物理、化学和生物法，例如：活性炭吸附、化学氧化及好氧/厌氧生物降解等。物理和化学处理法往往存在降解不彻底，容易引起二次污染等问题，而生物处理法具有相对经济、没有二次污染等特点，正越来越引起重视，并已成为一种被人们普遍接受和认可的环境治理技术之一[3]。氯酚类化合物的生物降解一直是国内外研究的一个重要课题，已有一些学者从受2,4,6-TCP污染的水体、底泥和土壤中发现并分离出能够降解2,4,6-TCP的微生物[4-10]，但却鲜有关于光合细菌降解2,4,6-TCP的报道。
  光合细菌(Photosynthetic Bacteria简称PSB)是具有原始光能合成体系的原核生物，是一大类水生的、能进行不放氧光合成代谢的细菌类群的总称。在不同的环境中，光合细菌会表现出多种代谢途径，能在厌氧光照、好氧光照或好氧黑暗条件下利用低分子有机物，使废水得到净化，因此，光合细菌在染料、芳香化合物等有机废水的处理中得到广泛的应用[11]。张松柏等[12](2008)利用光合细菌PSB07-6降解苄嘧磺隆，对350 mg/L的苄嘧磺隆5天后降解率可达25.03％；E.I.Madukasi等[13](2010)利用一株从土壤中分离筛选得到的紫色非硫光合细菌Z08处理制药废水，取得了较好的效果，5天后COD去除率达到80%。目前，关于光合细菌降解环境污染物的研究大多是以纯菌种为对象，较少有对混合菌的研究[14-15]，但由于纯菌种在培养过程中培养基等需要灭菌，易受杂菌污染，因此很难在实际废水处理工程中应用。基于以上目的，本文选用红螺菌科混合光合细菌PSB-DR为实验菌种，对于该菌本实验室[16]已研究了其对废水中对硝基苯酚的降解情况，PSB-DR能在12小时内将100 mg/L的对硝基苯酚完全降解。而本文则利用该菌来降解2,4,6-TCP，在实验室条件下考察其降解2,4,6-TCP的最佳条件并对降解动力学进行了研究，以期为深入探索其降解2,4,6-TCP的机理和氯酚类化合物废水生化处理提供一定的理论依据和实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验菌种：光合细菌PSB-DR种子液购自某环保科技有限公司已产业化的商品菌种。
PSB培养基：选用典型的光合细菌生长培养基，以光合细菌典型的生长氮源氯化铵作为培养的氮源，以醋酸钠作为培养的碳源。具体成分如下：CH3COONa 2.4 g，NH4Cl 1.2 g，K2HPO41.55 g，KH2PO4 0.65 g，大量金属元素MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2 0.059 g，FeSO4·7H2O0.012 g，微量元素(Cu，Mn，Mo，Zn)1 mL，生长因子包括泛酸1.0×10-3 g，VB11.0×10-3g，生物素1.0×10-5 g，蒸馏水1 L，pH 6.8~7.0；降解实验培养基(模拟废水)：在上述PSB培养基的基础上调整碳源和氮源的量并加入适量的2,4,6-TCP。
试剂：2,4,6-TCP为分析纯(98%)，购自上海晶纯试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，上海陆都化学试剂厂；其他试剂未经特别说明，均为分析纯。
1.2实验方法
菌种的扩培：将光合细菌PSB-DR种子液以50%(体积比)的接种量接种至含有100 mLPSB培养基的锥形烧瓶中，在光照培养箱中(30℃、4800 Lx)扩大培养5天至菌悬液成深红色后，再按50%的接种量转接到新的培养基中扩培5天左右，如此连续进行3次转接培养，以获得大量的光合细菌。由于实验采用的培养基是适宜光合细菌生长的，接种时光合细菌又为优势菌群，培养过程缺少其它微生物生长所需的营养物质，导致其它微生物逐渐消亡，所以扩培后的菌悬液中基本为光合细菌菌群(扩培后对菌体活细胞吸收光谱进行了测定，见图1，最大吸收峰在375、525、590、803、850 nm处，表明存在菌叶绿素和类胡萝卜素，菌体活细胞吸收光谱具有光合细菌的典型吸收特征，这从侧面提供了佐证)，将3次转接培养后的菌悬液用无菌水调节其光密度值为3.0左右作为降解实验的原菌液备用。
图1 菌体活细胞吸收光谱
Fig.1 In vivo spectrum of the mixed cultures
2,4,6-TCP的降解：取一定量上述培养好的原菌液在12000 r/min下离心10 min，弃上清液，菌体用磷酸盐缓冲液洗涤2次后接种于含50 mg/L2,4,6-TCP的模拟废水中，分别考察光照和溶氧、模拟废水初始pH、醋酸钠及氯化铵浓度对2,4,6-TCP的降解率和细菌生长的影响。规定条件：好氧光照培养(250 mL锥形瓶装2/3培养物，敞口静置；光照度：4800 Lx，温度30℃，每天振荡2次)，pH 7.0，接种量为30%。实验中，改变1个影响因素，固定其他条件，从而确定最优降解条件。光照培养7天，每隔1天取样一次，并测菌悬液浓度，样品经12000 r/min离心10 min后，取上清液经0.45 mm滤膜过滤后用高效液相色谱测定2,4,6-TCP的浓度，每组实验设2个平行，重复2次。
1.3 分析方法
菌悬液浓度：菌悬液浓度用UV-759S紫外-可见分光光度计测定，检测波长为510 nm，并以光密度值(OD510)表示。论文写作，降解动力学。
活细胞吸收光谱的测定：扩培后的菌悬液以转速12000 r/min离心10 min，用质量分数为60%蔗糖水溶液洗涤处理3次后，将离心后的菌体细胞悬浮于蔗糖水溶液中，用紫外-可见分光光度计在波长200～900 nm扫描。论文写作，降解动力学。
2,4,6-TCP浓度的测定：2,4,6-TCP浓度的测定采用高效液相色谱仪(Jasco LC2000)。分离柱为ODS-C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，0.5 μm)；流速为1 mL/min；紫外检测波长为210 nm；流动相为甲醇/水=90:10(体积比)；柱温为室温；进样体积为20 μL。2,4,6-TCP出峰时间为5.2 min。
2,4,6-TCP降解率的计算：降解率E(%)=［(培养基初始2,4,6-TCP质量浓度－培养7天后培养基2,4,6-TCP质量浓度)/培养基初始2,4,6-TCP质量浓度］×100%
2 结果与讨论
2.1 光照与溶解氧对细菌生长及降解率的影响
将培养好的光合细菌原始菌液接种到2,4,6-TCP浓度为50 mg/L的模拟废水中(接种量为30%、初始pH为7.0，醋酸钠含量0.4 g/L，氯化铵含量0.6 g/L，除光照溶氧外其他条件均一致)，分别在黑暗好氧、黑暗厌氧、光照好氧、光照厌氧(厌氧条件：锥形烧瓶装满培养物并用橡胶塞进行封口)条件下培养7天，每隔1天测菌悬液浓度并取样测定2,4,6-TCP的浓度。
实验结果见图2。由图2可知PSB-DR在黑暗好氧、黑暗厌氧、光照好氧、光照厌氧的条件下对2,4,6-TCP的降解情况存在较明显差异，7天后2,4,6-TCP的降解率分别为5.3%、6.7%、71.3%、54.4%，光照条件下2,4,6-TCP的降解率远高于黑暗条件；黑暗条件下2,4,6-TCP的降解率略低于空白组(未接种的空白组损耗为8.4%，其对分析2,4,6-TCP降解效果的干扰并不大，故在后续实验中忽略其损耗)，可以认为黑暗条件下2,4,6-TCP基本没有被降解。对比上述四组数据可以看出光照对2,4,6-TCP降解率的影响远大于溶氧对其的影响。R.Blasco等[17]在研究Rhodobacter capsulatus ElF1降解硝基酚时发现其对2,4-DNP的厌氧降解是严格光依赖的，光照是其降解的限制因子。在光照条件下，光合细菌可捕捉光能，并转换成化能ATP供细胞合成及降解基质之用(图2中光照条件下细菌的生长较好，黑暗条件下则不生长)，光照还可能与某些降解酶的作用有关，因此，光照在本实验中成为2,4,6-TCP降解的关键限制因子。另外，从图2中可知，在光照厌氧和光照好氧条件下，细菌的生长状况较接近(厌氧略微优于好氧)，但好氧条件下2,4,6-TCP的降解率却高于厌氧条件，这可能是由于PSB-DR更倾向于通过氧化脱氯机制完成对2,4,6-TCP的降解作用，在厌氧条件下，细菌经过2天的适应后也能对2,4,6-TCP起到一定的降解效果，其原因可能与光合细菌的代谢多样性有关。综上，在本实验中选择光照好氧条件作为降解2,4,6-TCP的较优条件。
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