| 采用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒提取重组质粒DNA，经PCR鉴定后，筛选出含有正确插入片段的重组克隆送上海英俊公司进行序列测序，用ABI3730测序仪完成测序。所得序列用BLASTn和BLASTx软件与GeneBank中的序列进行同源比对分析(NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
2结果与分析
2.1根结线虫形态鉴定结果
挑取病株根结进行观察，可以看到根结外有透明黄褐色胶质包含着的卵囊，在显微镜下可以看到卵囊里充满了长椭圆形的卵，挑取卵囊，可以看到与卵囊紧密相连的呈梨形的雌虫，虫体乳白色，前体部突出呈现为瓶颈状，后体呈现为球形，食道垫刃型，中食道球发达，具有口针（图1）。二龄幼虫线形，长度约为500um，头部可以看到发育良好的食道腺和口针（图2）。
观察到的形态特征与刘维志等对南方根结线虫的特征描述相一致，由此初步判断病原线虫为南方根结线虫。
 
图1南方根结线虫雌成虫图2南方根结线虫2龄幼虫
Fig.1ThefemaleimagoofM.incognitaFig.2The2stagelarvaofM。incognita
2.2根结线虫rDNA–ITS的PCR扩增结果检测和序列分析结果
      将试验获得的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上检测，检测时，六次重复，得到一条大约800bp的条带（图3）。
六次重复的电泳结果完全一致。说明的到的序列是线虫rDNA–ITS的特异扩增结果。重复性和一致性极好。
2.3根结线虫rDNA–ITS的PCR扩增片段的序列分析
将所获得的克隆通过测序得到一条766bp的片段，测序后，以通用引物为测序引物，用ABI3730测序仪完成测序。产生的序列去除载体和接头序列后，在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLASTn和BLASTx软件与GeneBank中的序列进行同源比对分析。它与南方根结线虫(M.incognita）的ITS区编码序列AY438556具有同源性，相似度达到100％，排除期望值为Expect=0.00。所以判断所得到的线虫为南方根结线虫（M.incognita）。南方根结线虫的ITS区序列如下：
1TTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTGCCCGGGACT51GAGCCATTTCGAGAAATTTGGGGACCGTTGATTTAATTTTTCTAAATTACT101TTGATGGAAACCAATTTAATCGCAGTGGCTTGAACCGGGCAAAAGTCGTA151ACAAGGTAGCTGTAGGTGAACCTGCTGCTGGATCATTACTTTATGTGATGTT201CAAATTTGAATTCGCAATGAAATGATCGTTGTGAAACGGCTGTCGCTGGT251GTCTAAGTGTTGCTGATACGGTTGTGAACGTCCGTGGCTGTATATGTGGT301GACATGTTAGGACTCTAATGAGTTTAAGACCTAATGAGCCTCTTAAGTGA351GGCCGCCAGCAACCTTTTTTTTCTCTACATTTTAAAAAAAAAACTAAAAT401TCTACCCTTATCGGTGGATCACTAGGCTCGTGGATCGATGAAgAACGCAGC451AAACTGCGATAATTATTGCGAACTGCAGAAGTATTGAGCACAAAAGTTTT501GAACGCAAATGGCCGCATTGAGGTCAAACTCTTTGCAACGTCTGGTTCAG551GGTCATTTTCTCTTATAGCGGAAGCTTTAATTTCTATAATGATGTTGTTG601CTTTATATTTTAAAAGGATTTTTGTTTATTCATGTATTAAATCTAACTGT651GAAAATCAAACAATTTTGACCTGAACTCAGTCGAGAGCACCCGCTGAAC701TTAAGCATATCAGTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAAATAGGATTCCCTTAG751TAACGGCGGTGTGAAA
综合症状、形态学上的观察和提取的线虫ITS区域片段的对比结果，可以判断采集到的线虫为南方根结线虫，通过单卵块的繁殖可以保证获得供试线虫的纯度。
3讨论与结论
根结线虫的鉴定方法主要分为形态鉴定和分子鉴定两种方法，形态鉴定法中又以雌虫会阴花纹和同工酶鉴定方法为主，但雌虫会阴花纹个体间常常存在差异，并且在标本制作上需要一定的技巧，同工酶鉴定虽然较为准确，但却需要年轻雌虫的存存，而土样中往往只含有幼虫，因而限制了该方法的应用。近年来国际上兴起了适用于根结线虫各虫态的分子诊断法的研究，在多种果树根结线虫病害以及多种线虫群体的鉴定上发挥了重要作用。 2/3 首页 上一页 1 2 3 下一页 尾页 |
