京秀葡萄四倍体诱变研究初报_秋水仙素

论文导读:：近年来，早熟、大粒的四倍体葡萄深受市场的欢迎。但目前，葡萄四倍体品种数量较少，遗传背景狭窄，因此，四倍体葡萄诱导对于育种和生产都具有重要意义。本试验以秋水仙素为诱变剂，采用浸泡单芽茎段法和混合培养法对京秀葡萄进行组培诱导，探索秋水仙素浓度以及不同处理方法对变异的影响，并利用流式细胞分析仪对诱变效果进行分析。结果表明：对于浸泡单芽茎段法，浓度的影响强于处理时间，最佳诱导浓度及时间为0.3%处理24小时；而对于混培法，处理时间的影响却强于浓度，最佳诱导浓度及时间为2000mg/L处理30天。
论文关键词：葡萄，秋水仙素，四倍体诱导，倍性分析
 

多倍体育种可以高效率的改变果树的某些性状，从而提高产量，改良品质，增强抗逆性，因此，多倍体育种倍受果树育种学家青睐^[1][2]。近年来，早熟、大粒的四倍体葡萄深受市场的欢迎。但目前，葡萄四倍体品种数量较少，遗传背景狭窄，多为巨峰的后代^[3]。因此，四倍体葡萄的诱导对葡萄育种和生产都具有重要意义。葡萄四倍体育成的方法主要有人工诱变、有性杂交和自然选择等方法，其中人工诱变法是葡萄四倍体育种常用的方法^[4]。本试验以秋水仙素为诱变剂，对京秀葡萄进行组培诱导，探索秋水仙素不同浓度以及不同处理方法对诱变染色体变异的影响，利用倍性分析仪对诱变多倍体整株进行分析鉴定，以期为葡萄四倍体的诱变寻找简单有效的途径。

1.材料与方法

1.1培养基和培养条件

试验采用MS培养基,添加0.6%的琼脂粉，2.5%蔗糖。PH调至5.5。采用湿热灭菌法，用手提式高压锅灭菌，121℃保持15分钟。激素和秋水仙素在灭菌前加入。培养条件：25士2℃，光照强度为2000Lx，日照时间12h小时的培养室中进行培养。

1.2浸泡单芽茎段法诱导四倍体

将无菌的带单芽茎段浸泡在各浓度（0.05﹪，0.1﹪，0.2﹪，0.3﹪秋水仙素，0.4﹪）的秋水仙素中，包好瓶口，避免强烈光照，分别处理6h,12h, 24h，48h，72h。处理过程中轻轻摇动以使诱导材料与药液充分接触，以无菌水为对照，处理后接种到培养基(MS+6-BA(2.5mg/L)+IBA(0.1mg/L) )上培养。待腋芽萌发后取部分芽尖进行倍性鉴定，生根诱导(1/2MS+IBA(0.5mg/L)) 20天后取根尖进行倍性鉴定，研究植株倍性变化中国论文下载中心。培养30天后对组培苗的生长量进行测定。

1.3混培法诱导四倍体

将一定浓度的秋水仙素水溶液加入MS培养基中，配成分别含秋水仙素50mg/L、100mg/L 、500mg/L 、1000mg/L 、2000mg/L经高压灭菌。选取苗龄12-15天左右根系长为1.5cm的健壮组培苗，带根转入尚未完全凝固含秋水仙素的培养基中，每个梯度处理10株，重复三次，分别处理15d、30d、40d后，剪取芽尖进行倍性检测。

1.4倍性检测

使用美国BD公司生产的FACSAria型流式细胞分析系统测定单个细胞核的DNA含量，通过倍性分析仪对植株进行倍性检测。对诱导后的植株进行倍性分析，应以未经处理的京秀二倍体为对照。具体方法如下：取生长良好的组培苗的根尖50mg或茎尖30mg，在滴有1mL提取缓冲液 [15 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),80 mmol/L KCl,20 mmol/L NaCl,20 mmol/LEDTA-Na^-2,15 mmol/L巯基乙醇和0.05%(v/v) TritonX-100]的培养皿中用锋利刀片迅速切碎，260目尼龙网包住移液枪头过滤吸取，再通过400目细胞筛过滤, 滤液用标准试管收集，暗处放置3小时，加入0.5mL Rnase A溶液[100mgRnase A溶于10ml10mMTris-HCl（PH7.5），15mM NACL中，100℃煮沸15min，冰浴冷却，-20℃保存]，置暗处，37℃培养30 min，冰浴冷却再加入10μg/mL 碘化丙锭0.6mL，随即上机测定。

2.结果与分析

2.1 诱导前京秀的葡萄倍性检测

取生长良好的京秀组培苗，取其根尖50mg及茎尖30mg，分别提取并过滤，按1.4的方法进行测定，测定的结果为二倍体，如图1。

a. 茎尖DNA含量分布图b.根尖DNA含量分布图

a. Distribution of DNAcontent in stem tipb. Distribution of DNA content in root tip

图1京秀茎尖及根尖DNA含量分布图

Fig.1 Distribution of DNA content in stem tip and root tip of“jingxiu”

2. 2浸泡单芽茎段法诱导四倍体对植株生长情况的影响

在生长过程中，京秀组培苗茎段生长分化受到抑制，对组培苗生长30天后的生长量进行测定发现：秋水仙素的抑制作用随浓度和时间的增长而加重，浓度越高或同一浓度条件下浸泡的时间越长，植株的生长量越小。秋水仙素浓度为0.05%时，不同时间处理间植株生长量差异不显著。0.2%和0.3%浓度下，浸泡12和24h处理的试管苗株高度显著低于与浸泡6h处理的株高。而在对茎段浸泡时间相同条件下，0.1%和0.2%浓度处理间的植株生长量不存在显著差异。而0.4%浓度处理，在24h-72h间植株生长都受到严重的抑制，根系变短变粗，且根系的分支数量变多，几乎不生长。

图 2 秋水仙素浸泡单芽茎段法的植株生长

Fig.2 Plant growth of shoot segments pretreatmentwith colchicines by soaking

表 1 秋水仙素浓度和处理时间对京秀诱变效果及生长的影响

Tab.1 Effect of pretreatments with colchicines oninduction and growth of “jingxiu”

从表1可以看出，0.05%浓度下处理6h成苗率最高秋水仙素，随着秋水仙素浓度及处理时间的增长，京秀葡萄的成苗率在总体上呈下降趋势。同一时间处理下，褐化率随着秋水仙素浓度增大最慢的是6h处理，最快的是72h处理，成苗率下降最慢的也是6h处理，但最快的却是48h处理。同一浓度处理下，随着处理时间增长，低浓度处理的成苗率的下降速度及褐化率的升高速度要都低于高浓度处理，例如，0.05%浓度下，处理6h的褐化率和成苗率分别为13.33%和86.67%，处理12h的褐化率和成苗率分别为26.67%和73.33%，处理72h时仍旧有20.00%的成苗率；0.4%浓度下，处理48时的成苗率和褐化率已经达到0.00和100.00%，而且，0.4%浓度与其它处理浓度相比，在所有时间处理下，其成苗率始终最低，褐化率也始终最高。可见高浓度的秋水仙素毒害作用重于长时间的浸泡处理。

2. 3混培法诱导四倍体对植株生长情况的影响

在含秋水仙素的培养基未完全凝固时，将根系生长良好的组培幼苗接入。培养15、30、45天后观察发现：组培苗根的生长普遍受到抑制，植株生长变慢，叶片变深绿，腋芽很难萌发，浓度越高，抑制作用越强；尤其是苗龄较小的植株，不仅嫩芽停止生长，而且整个植株都逐渐枯死；有些成活的植株除了生长缓慢外，新发叶片变皱，叶缘下卷，继代后变大变厚，颜色为深绿色，茎和根均略粗。

表2秋水仙素混培法对京秀诱变效果及生长的影响

Tab.2 Effect of mixed culture with colchicines on induced polyploidyand growth of “jingxiu”

从表2可以看出，500mg/L浓度下15d处理的成苗率最高。在本混培处理实验中，表现出了处理时间对组培苗生长的影响作用强于处理浓度的现象，这体现在以下两个方面：其一，同浓度下，随着培养时间的增加，死亡率、褐化率升高明显而萌芽率下降也显著，如浓度在50mg/L水平上，培养15天时死亡率为零，褐化率为26.27%，萌芽率为70%；培养45天时死亡率上升到23.33%，褐化率为36.33%，萌芽率大幅下降为30%。而同时间处理下，随着秋水仙素浓度的增加，萌芽率、褐化及死亡率的变化规律虽同前者，但变化速度缓慢，而且15天的处理的萌芽率还出现了先升再降的趋势。其二秋水仙素，长时间（30天，45天）处理即使在低浓度（50 mg/L）下，其萌芽率还是显著低于短时间（15天）中浓度（100-1000 mg/L）处理的萌芽率。

2. 4诱变植株的倍性鉴定

图3为京秀的四倍体、二、四倍嵌合体和二倍体的DNA含量分布图。四倍体植株在接近100的位置上出现一个单峰；二、四倍嵌合体具有2个峰：除50附近的位置有1个峰外，在位于其DNA含量一倍的地方还有一个峰，约等于2；二倍体对照植株仅在荧光强度值为50的位置上出现一个单峰。经FACSAria型流式细胞仪中软件分析，得到嵌合体中不同倍性细胞的相对比例。如图3所示的京秀嵌合体图谱，二倍体细胞所占比例为47.13%，四倍体细胞所占比例为52.87%，该结果也以峰面积形式体现出来，以此结果可以了解诱变株中不同细胞的情况。

a. 四倍体京秀b. 二、四倍体嵌合体京秀c. 二倍体京秀

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