| 取轰击后的香蕉根、叶片和果实薄片于26℃暗培养24～48h。然后进行荧光显微镜观察、组织化学染色和基因枪轰击后24h的转化材料GUS活性比色测定，以GUS提取液中每mg总蛋白在1min中生成对硝基苯酚的微摩尔数为一个酶活单位。
2结果与分析
2.1序列分析
对BanLec序列进行NCBIBLASTn比对分析，结果表明670bp的连续序列与BanLec启动子（登录号为DQ7939.1）同源性在97%，有340bp的序列是首次分离（图7），证明1014bp序列为香蕉凝集素基因的上游序列，如图1。
图1NCBI比对结果
Fig.1ResultofNCBIblastn
通过Promoterpredictions、PlantCARE等软件进行基础启动子区及调控元件分析，结果表明在-89～-138bp,-221～-270bp和-499～-548bp存在三处可能的基本启动子区。可能含有32个顺式作用元件，并含有OSE1ROOTNODULE等多个组织特异作用元件（图2、表1）。
CCCAAAATAACATCGTTAGAGAGGAGGATAGTTGACCTCCTTCATTCTCTCCCATAAATATGTAGGAACTCAGGGATATACGATTTCCCTAGATAACACAATCTCCTTTGTACGCGCGGTTTTCTATTTTACGAGTTTTTACATGTCAAGCTTCGCAAGATGACGAACACCTTTTAGAAAATTTGAGATTTTTATTTTCTATTTTTCCACTGCATATGTGATGTCGCCCTTAGATTTCCCTATGGTTGTGTCATATTGATACTTATACATAAGAACTTTTTGAGATGATATATTACCTTGGATTCCTTGTTACGAGATCATTTGTGGCTTACAAAATTCATCTTTGTATTATGAATTGTCCATCAAGTATTTTTAATTTATTTTTTATAAATTCTTAAAAGATCCTAGAACGTTAATCCCTTTGGATCAATATATAAAAGTGACATACGACTTAGAAAAAATCAAATAAAATTAAATATAAATATATATTTATGAAGAATAAATTAAAATTTTGTATTACTTAATCATATCCTACATATCTACGATCTGCACCATCAAACCAAAAAAAAAGGGGGTTATCTCTCCAACGTAGCCGAAGTATTGAACTCTCAAGTCCCCCCAACACGTTTCCATGTGTCGACCGCCACGCCATATCCTTATCCGCTCCTCTTTAATTATTGACCACACCACCATCCGTGATCGTCGCCAGTCACGTCTTCGTCGTCGAGAGGCTCTACACGACCCTCGTCACGTGATACACGCTTTCCTCGAGGAAGCCACGGGCGAGGGGGTGAGCGGTACACCTCCATTCCACCCCGACATCAGAGCCATGGCGATCCGCTATAGGTAGCCTCTCTCCCTCTTCCCCAACATTATCTTCTGCAGAAGAAAGGGAGGAGTTTGGTACACACAACACGATGGTGAGAGGCTCTCTATACACACATAGTTTTCTGTCTGTGGAACAGTTTGGTTACCTCCGTGCGTCGTGTGTCGACGTC
图2BanLec基因启动子序列
（图2中：预测的基本启动子序列；转录起始位点CCA；TATA盒）。
Fig.2NucleotidesequenceofclonedBanLecgenepromoter
Predictedbasicelementsofpromoter,CCA:potentialinitialpointsoftranscription,TATA:TATAbox
|
名称
|
代表序列
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序列中位点
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功能
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|
ABRE
|
ACGT
|
585、750
|
脱落酸响应的顺式作用因子ABA反应元件
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|
ACGTABOX
|
TACGTA
|
588
|
与糖压力相关
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|
CAATBOX1
|
CAAT
|
255、355、428、602、679、998
|
组织特异性元件
|
|
CAAT-box
|
CC、CA
|
93、128、224、284、532
|
启动子及增强子区域通用的顺式作用元件
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|
CGTCA-motif
|
CGTC
|
747
|
与茉莉酸响应有关的顺式调节元件
|
|
G-Box
|
CACA
|
624、750
|
光反应顺式调控元件
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|
WBOXNTERF3
|
TGAC
|
32、160、710
|
与伤害相关元件
|
|
GA-motif
|
AAAGATGA
|
337
|
缺氧特异诱导的类增强子元件
|
|
HSE
|
GAAA
|
175
|
热反应相关元件
|
|
I-box
|
ATAT
|
650
|
光反应相关元件
|
|
TATA-box
|
TATA
|
76、126等
|
核心启动子元件
|
|
TATC-box
|
TATC
|
193
|
赤霉素反应顺式元件
|
|
TCA_element
|
AGAA
|
549
|
水杨酸反应顺式元件
|
|
TCCC-motif
|
TCTC
|
280、521
|
光反应元件
|
|
DPBFCOREDCDC3
|
ACACNNG
|
633
|
与ABA反应相关元件
|
|
CANBNNAPA
|
CNAACAC
|
164、621
|
胚与胚乳特异性元件
|
|
CATATGGMSAUR
|
CATATG
|
213
|
参与生长素调节
|
|
GATABOX
|
GATA
|
27、75、92、258、287、756
|
光控制元件和组织特异性表达元件
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|
TATABOX5
|
TTATTT
|
192、378
|
谷氨酰胺合成酶相关元件
|
|
WBOXATNPR1
|
TTGAC
|
32、680、991
|
水杨酸反应相关元件
|
|
WRKY71OS
|
TGAC
|
33、161、441、681、
|
赤霉素相关元件
|
|
OSE1ROOTNODULE
|
AAAGAT
|
398
|
组织特异性序列
|
|
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A
|
CCTTTT
|
170
|
赤霉素反应瞬时作用元件
|
|
TGA-box
|
TGAC
|
656
|
植物激素响应元件
|
|
Chs-CMA1a
|
TTAC
|
869
|
光响应元件
|
2．2瞬时表达结果
取基因枪转化24h香蕉叶、根、果在荧光显微镜下观察（图3）所示，转化香蕉凝集素基因启动子的植物表达载体p1304BanLec香蕉材料的根、叶均未发现绿色荧光，而只在果实中特异表达；含有35S启动子的pCAMBIA1304植物表达载体香蕉材料根、叶、果实均有绿色荧光；以水为阴性对照的根、叶、果实均没有绿色荧光。
以香蕉幼叶、根、果实为受体材料，基因枪法转化后，受体材料培养16h，染色24h结果如图4所示，p1304BanLec载体包被的微弹轰击的材料，叶片、根在显微镜下没有观察到蓝色，而果实薄片在果肉中观察到蓝色。pCAMBIA1304包被的微弹轰击的叶片、根、果实均在显微镜下观察到蓝色。水包被的微弹轰击的材料，叶片、根和果实薄片在显微镜下均未观察到颜色。
2.3pCAMBIA1304与p1304BanLec及pBIL2转化香蕉不同材料中GUS活性检测
基因枪转化后24小时取不同反应时间、相同重量的基因枪轰击的果实薄片制备GUS提取液，酶反应后测得415nm处两种果实转化材料GUS提取液不同反应时间的光吸收值，将其换算成消光产物量后对时间作图。 2/3 首页 上一页 1 2 3 下一页 尾页 |
