Wasabi植物生物活性物质提取及其抗癌作用的研究

论文导读:：为了开发wassabi的药用价值，采用萃取和蒸溜方法，提取Wasabi中生物活性物质异硫氰酸酯，并用提取的异硫氰酸酯对肝癌细胞的作用进行了试验，以弄清楚Wasabi中异硫氰酸酯的含量及其抗癌作用。研究结果表明，Wasabi中异硫氰酸酯含量为须根中0.53mol•mL^-1, 根茎中0.80mol•mL^-1 , 叶柄中0.27 mol•mL^-1 。Wasabi中异硫氰酸酯对肝癌细胞有明显的杀死作用，用异硫氰酸酯和肝癌细胞的比例为0.15mL +0.05mL处理肝癌细胞90min，使肝癌细胞完全失去活性，不会再引起疾病。这为Wasabi中生物活性物质异硫氰酸酯的提取及其抗癌药用价值提供了科学依据。
论文关键词：瓦莎芘，生物活性物质，提取，肝癌细胞，失活
 

前言

Wasabi是十字花科山嵛菜属多年生宿根草本植物。日本自九世纪栽培以后，台湾在1918年由日本引种至阿里山，1992年福建漳平县开始引种， 现在Wasabi在我国形成了一定的栽培规模。其根茎每公斤售价可达200多元人民币。但是，目前除了对Wasabi的栽培技术进行了大量的研究外，对Wasabi中生物活性物质的抗癌方面的研究尚少，在所检索的文献中未见报道，只有日本小岛与伊奈和夫等人曾采用气质联用技术将来自不同国家（日本、中国、加拿大）的原料的水解挥发性含硫化合物及其相对含量进行过检测比较的报道^{[1生物论文，2]}。因此本研究受厂家的委托旨在对Wasabi中生物活性物质异硫氰酸酯的提取及其对肝癌细胞的作用进行研究，以便为更好地开发利用Wasabi植物提供理论和技术依据 论文开题报告范例。

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1山葵 Wasabi根茎、须根和叶柄（图1）由云南天长绿色有限公司提供，肝癌细胞和试验小白鼠由三医大提供。

1.1.2药品 乙醇，乙醚，丙酮，派啶，六氢吡啶，溴甲酚绿，甲基红，开米蔬

果清洗剂（GB9985-2000），邻苯二甲酸氢钾，维生素C等 。

1.1.3仪器设备 高速离心机（4000r/min以上），真空干燥箱，倒置显微镜，组织捣碎机，无菌室及超净工作台，-40℃至-80℃低温冰箱生物论文，蒸溜器（图

2），以及进行动物试验的各种材料设备器械等^[3]。

1.2 方法

1.2.1Wasabi中异硫氰酸酯的提取及工艺流程

原料处理→ 称量100克，洗涤，切碎，组织捣碎机捣碎匀浆→加0.1% Vc 40℃密闭水解1-2h→ 水蒸气蒸馏，采用蒸馏-萃取与同时蒸馏萃取两种方式→脱水、冷冻过夜 →旋转蒸发仪浓缩→ 无水乙醇洗涤稀释得WSB有效成分提取液→测定有效成分异硫氰酸酯→ -20℃冷冻保藏备用

将新鲜Wasabi须根、根茎、叶柄用流水冲洗净泥沙，分别用0.5%开米蔬果清洗剂溶液浸泡搓洗5分钟，再用冷开水冲洗干净。分别用无菌刀切碎后用组织粉碎机打浆（按1：1加水）。打浆后用乙醇（或者乙醚、丙酮）按1：0.4-1.0比例混合。此时加入pH为4.2的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液（按1：0.5加入）、维生素C0.1%，混合均匀后，在30℃水解萃取2h。最后经过蒸溜器蒸溜出异硫氰酸酯，再经过浓缩去除多余水分。再用细菌过滤器抽滤除菌后备用。

图1. Wasabi根茎部分图2. 蒸溜装置

Fig. 1 wasabi rhizomepart, Fig. 2 distilling apparatuses

1.2.2 异硫氰酸酯的检测

采用派啶滴定法和六氢吡啶法以及色谱法测定溜出物中异硫氰酸酯的含量^[4，5]。Wasabi中葡萄糖甙异硫氰酸钾在天然的硫代葡萄糖甙水解酶作用下发生水解放出异硫氰酸酯，再用派啶的丙酮溶液发生均相反应论文开题报告范例。就可计算出异硫氰酸酯含量，反应为：

SC₆H₁₁O₅ 硫代葡萄糖甙水解

R-CR –N=C=S +C₆H₁₂O₆+KHSO₄

NOSO₃K 酶 ，H₂O+HN(CH₂)₅

R-NH-C-N(CH₂)5

‖

S

1.2.3异硫氰酸酯对肝癌细胞的作用试验

癌症是对人类威胁最严重的疾病。Wasabi中异硫氰酸酯的提取及其对癌症细胞的作用研究是受厂家的委托进行的。采用提取的异硫氰酸酯处理肝癌细胞，按照提取的异硫氰酸酯与肝癌细胞的比例为0.04mol?L^-1异硫氰酸酯的浓度和1×10⁵个?mL^-1的肝癌细胞混合，培养箱中培养24h后生物论文，用5%胎盘兰染色液染色5分钟，计算活细胞数，计算异硫氰酸酯对肝癌细胞的杀死率。

1.2.3.1 Wasabi中异硫氰酸酯对体外癌细胞的抑制率

取对生长旺盛期的癌细胞1×10^5个?mL^-1，每孔0.2mL接种三个96孔培养板中，用盐水作为对照组，置37℃，5%CO₂培养箱中分别培养24、48、72小时，实验终止前4小时每孔加MTT工作液（5mg?mL^-1）10uL，上机前去除培养液，每孔加200uL二甲基亚砜，酶标光度计570nm波长测量各孔吸光度（OD值），按下式计算细胞生长抑制率。

1.2.3.2异硫氰酸酯）对小鼠体内癌细胞成瘤的抑制作用

Wasabi的馏出液处理的癌细胞在小鼠体内的成瘤实验，用肝癌细胞经Wasabi中的异硫氰酸酯、PBS缓冲液处理60分钟后，分别接种于小鼠皮下，接种量为1×10⁶个/只鼠，观察并计算其成瘤率及成瘤时间。

1.2.3.3Wasabi中的异硫氰酸酯注射小鼠体内的抑瘤试验

将肝癌细胞按接种量为1×10⁶个/只鼠 接种于小鼠皮下，当在体内成瘤后生物论文，分别注射Wasabi的异硫氰酸酯，每鼠100ug/d，及注射PBS的对照组，连续处理30天后处死，观察成瘤率及测量成瘤率的大小。

2. 结果与分析

2.1Wasabi中异硫氰酸酯的提取及其含量的测定

用萃取-蒸溜方法从Wasabi中提取异硫氰酸酯后，用色谱法以及哌啶法和吡啶法测定并计算异硫氰酸酯的含量^[6]，结果见图3和表1。哌啶法计算公式如下：

异硫氰酸酯（%）= 0.099（N₁V₁-N₂V₂） ×100

­V₀

式中N₁—派啶溶液的当量浓度

N₂—标准盐酸溶液当量浓度

V₁—测定时所用派啶ml

V₂—滴定时所用标准盐酸溶液

0.099—毫克当量烯丙基异硫酸氰酸。 V₀—取样品体积mL

六氰吡啶法计算公式：

99.15 （C₁V₁-C₂V₂）

异硫氰酸酯（%）= 1000

W

式中C₁—六氰吡啶标准溶液浓度

C₂—盐酸标准溶液浓度

V₁—六氰吡啶标准液加入体积

V₂—滴定时作用盐酸标准溶液体积

99.15—1moL烯丙基异硫酸的酯的质量，克

W—取样量，克

图3 有效成分异硫氰酸酯的含量色谱图

表1. Wasabi中生物活性物质异硫酸酯的含量

Tab.1 In wasabi allyl itc content

原料 提取方法 测定方法 测定值（mol?mL^-1） 含量（%）

须根 直接萃取 吡啶法 0.410.408

萃取-蒸馏哌啶法0.530.528

根茎 一次直接萃取 吡啶法0.630.628

萃取-蒸馏哌啶法0.800.796

叶柄 一次直接萃取 吡啶法0.180.179

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