| 表 2 菠萝EST-SSR的重复基元
Table 2The repeat motif of EST-SSRs in pineapple
|
重复类型
Repeat type
|
基元数
Repeat number
|
重复基元
Repeat motif
|
|
二核苷酸
Dinucleotide
|
10
|
AC、AG、AT、CA、CT、GA、GT、TA、TC、TG
|
|
三核苷酸
Trinucleotide
|
48
|
AAC、AAG、AAT、ACA、ACG、AGA、AGC、AGG、ATC、ATG、ATT、CAA、CAC、CAG、CCA、CCG、CCT、CGA、CGC、CGT、CTA、CTC、CTG、CTT、GAA、GAC、GAG、GAT、GCA、GCG、GCT、GGA、GGC、GTA、GYC、TAA、TAC、TAT、TCA、TCC、TCG、TCT、TGC、TGG、TGT、TTA、TTC、TTG
|
|
四核苷酸
Tetranucleotide
|
15
|
AAAC、AATC、AGAA、CATG、CCAT、CGGT、CTTT、GACT、GCGA、GCTC、TAGA、TATT、TCGA、TCTT、TTTA
|
|
五核苷酸
Pentanucleotide
|
21
|
AAAAT、AAAGA、AAATA、AAGAA、AAGCA、AATAA、ACCAT、AGAAG、AGATT、AGCTT、ATAAA、ATGAG、ATGGT、CACAA、CCACG、CTCGG、GATTA、TCTTT、TTATT、TTTTA、TTTTC
|
|
六核苷酸
Hexanucleotide
|
80
|
AAAAGA、AAAGAA、AACCCT、AAGAAA、AAGAAC、AAGCCG、AAGGAG、ACCACA、ACGCAC、AGAAAA、AGAAGC、AGAGGA、AGCACT、AGCAGA、AGCCCT、AGGAAG、AGGAGA、AGGATG、ATTAGT、CAGCTC、CATCTT、CCATAC、CCCTCC、CCCTCT、CCGCCT、CCGCGT、CCTCCG、CCTCTT、CGCAGT、CGGCAG、CGGCGA、CGTCCG、CGTGAT、CGTTTC、CTCCGC、CTGCTT、CTTCAT、CTTCCG、CTTCCT、CTTCTC、CTTTGA、CTTTTT、GAAGAG、GAAGCA、GAAGCT、GACAGG、GAGAAC、GAGAAG、GAGGAA、GATCCC、GCAGAA、GCAGGA、GCCGTC、GCCTAT、GCCTGT、GCGAAG、GCTCCT、GGGCAC、GTTGTG、TAGGGT、TATCTA、TATTTT、TCAAAT、TCAGCC、TCCTCT、TCGCAG、TAGGAT、TCGGCG、TCTCGA、TCTCGC、TCTTCG、TCTTTT、TGAAGC、TGATGT、TGCTTT、TTAGGG、TTCTGC、TTTCTT、TTTTCT、TTTTTG
|
图 1 菠萝EST-SSR二核苷酸不同重复基元的重复数量
Fig.1Number of SSR loci in dinucleotide repeats across the entirepineapple ESTs
图 2 菠萝EST-SSR三核苷酸不同重复基元的重复数量
Fig.2Number of SSR loci in trinucleotide repeats across the entire pineapple ESTs
图 3 菠萝EST-SSR基元长度分布
Fig.3The distribute of motif length of pineapple EST-SSR
2.3 EST-SSR引物筛选
根据所统计的SSR位点的EST序列信息，共设计了636对引物，从中根据二、三、四、五、六核苷酸在总SSR中所占比例选取30对引物，其中包含三条Over-laped SSR所对应的引物生物论文，对菠萝的基因组DNA进行PCR扩增中国学术期刊网。其中筛选出27对引物能扩增出清晰的，大小与预期片段相近的2-7条带，占扩增引物的90%，引物筛选结果见图4。筛选出的27对引物的详细信息见表3。该实验说明利用菠萝EST序列开发EST-SSR标记是高效且可行的。
2.4 EST-SSR靶向基因的功能分析
值得关注的是，EST-SSR使无功能的分子标记开始逐步向可以揭示有基因功能的分子标记发展[11]，筛选出来的菠萝27对引物所对应的EST，概念性翻译后经BLASTp分析，其中有11条为未知蛋白的mRNA序列，7条为还未发现的序列，其余9条EST的功能注释中有水分胁迫诱导蛋白、甲酰转移酶、衰老相关蛋白、脱水-应答蛋白PD22前体、30S核糖体蛋白质S9、核糖体蛋白L11类似物、新生多肽相关复杂α链、质膜H+-ATP酶、pop3肽、抑制蛋白以及菠萝成熟果实cDNA、新生多肽相关复合物α链。
图4 菠萝30对EST-SSR引物扩增结果
Fig.4Amplification results by 30 EST-SSR primers of Pineapple
表 3 菠萝EST-SSR引物筛选信息
Table 3 Information of PineappleEST-SSR primer screening
|
SSR loci
|
Accession
|
Product size/bp
|
Repeat motif
|
Tm/℃
|
Forward primers(5’-3’)
|
Reverse primers(5’-3’)
|
Function
|
The number of amplified bands
|
|
ACSSR1
|
DT338344.1
|
390
|
(GCT)7/(TGG)7
|
59.828
|
CGTTCAAGTTAGCAGAAGCTGA
|
CAGAAACACTTCCACAACCAAA
|
water stress inducible protein
|
7
|
|
ACSSR2
|
DT339079.1
|
290
|
(CCTCTT)3/(CTTCCG)3
|
60.247
|
AGATCGGGTTCTTCACTCTTCA
|
AGACAAGGTTCTTCTTTCGCAC
|
formyl transferase
|
4
|
|
ACSSR4
|
DT339555.1
|
399
|
(GA)16
|
60.055
|
AAGCCAAAGCAGACAAAAGAAG
|
TAGAACACCCAACTGGTTCAAA
|
unknown protein
|
7
|
|
ACSSR6
|
DT337477.1
|
388
|
(CT)17
|
60
|
CAGCAGATTTCGCAGGTGT
|
CTTGGCGCTGTTGATAATGTAG
|
unknown protein
|
2
|
|
ACSSR7
|
CO732232.1
|
393
|
(AG)16
|
60.381
|
AAGAGCAAGAGAGGAGTAGGGG
|
GAGAAAATTACAGGTGTTGGCG
|
unknown protein
|
4
|
|
ACSSR8
|
DT335862.1
|
394
|
(TA)9
|
60.001
|
TCAAGTTTGGTGGCTTCCTAAT
|
TTGTGTTGGCTTATGTCGTTTC
|
undiscovered sequence
|
5
|
|
ACSSR9
|
DT335902.1
|
397
|
(CT)21
|
59.094
|
GGGATGCTCCAGTTTCTGAT
|
ATTTATGATGGCGACCTTCTTC
|
senescence-associated protein
|
6
|
|
ACSSR10
|
CO731041.1
|
396
|
(AT)12
|
59.904
|
GTACGCGGTCTTCTACTGCC
|
GACTCCATGTTCACACGACAAT
|
putative dehydration-responsive protein RD22 precursor
|
6
|
|
ACSSR11
|
DT337447.1
|
398
|
(GA)11
|
60.336
|
TTAACTCCCATCTTCGTTTTGG
|
CTAGAGAGACCATACATCCCGC
|
undiscovered sequence
|
1
|
|
ACSSR12
|
DT338461.1
|
395
|
(TC)10
|
59.987
|
TTTCAGAGCTTTAGAGGATGGC
|
GGGTATCTTTGGCTACATCGAC
|
unknown protein
|
3
|
|
ACSSR13
|
DT338327.1
|
379
|
(AG)15
|
60.704
|
GGGGAAGAAGACGAAGAAGAAG
|
AAGCTATGCGAAGTAGACAGGC
|
unknown protein
|
3
|
|
ACSSR14
|
DT338672.1
|
394
|
(CT)15
|
60.17
|
GGTGTCTCAGGTCAGGTAGGAG
|
CGAAGTTTGCCTTTTGTTTGAC
|
putative 30S ribosomal protein S9
|
5
|
|
ACSSR15
|
DT338506.1
|
398
|
(CTA)12
|
60.665
|
GAATCCCCAGCATAGTTTCCTT
|
ATGGCCTTTTCCTCTCTCTCTC
|
undiscovered sequence
|
3
|
|
ACSSR16
|
DT337566.1
|
396
|
(TCT)8
|
59.767
|
CTCTTCCTCTTCTTCGTCTTCG
|
CACTGAAGTTTCTCCTCAGCAA
|
ribosomal protein L11 -like
|
6
|
|
ACSSR17
|
DT336908.1
|
393
|
(CAG)9
|
60.032
|
CTTGTCCATTAGCACCACAAAA
|
CCTCCTCCTCCTCCTCTGTTAT
|
unknown protein
|
5
|
|
ACSSR18
|
DT338459.1
|
387
|
(GAA)6
|
60.464
|
CAGATCGAGGACCAGATGAAAT
|
GCACCCAAATTCTTTTGTAAGC
|
unknown protein
|
3
|
|
ACSSR19
|
DT336929.1
|
383
|
(CAG)8
|
60.021
|
AGGTTATCCACCGCAAACTCTA
|
GCTGTTCTTGGTCCTGCTTATT
|
undiscovered sequence
|
3
|
|
ACSSR20
|
CO731978.1
|
378
|
(GAC)6
|
60.054
|
CGGTAACTGTAATTGTGCAGGA
|
AGTTTGGGCTCTTGAAAACATC
|
putative nascent polypeptide-associated complex alpha chain
|
3
|
|
ACSSR21
|
DT337637.1
|
383
|
(TCT)11
|
59.943
|
AAGGCAACGTAGAGAGGTGAAG
|
AAACCACACAAGGGAGAAAAGA
|
plasma membrane H+-ATPase
|
6
|
|
ACSSR22
|
DT337211.1
|
351
|
(AAAC)6
|
60.302
|
ATGAACCCTTCCCTTCTCCTTA
|
CTCCTTCCCACAAAATCAAAAC
|
undiscovered sequence
|
4
|
|
ACSSR23
|
CO731699.1
|
341
|
(GCGA)5
|
61.058
|
GGAGGGTCTCATCAAGGGATAC
|
GACAAATCTCGATCTCCACCTC
|
pop3 peptide
|
4
|
|
ACSSR24
|
DT336569.1
|
392
|
(AAAGA)5
|
59.757
|
GATCTCTTGCTCCAACTGGTTT
|
ATCTTCGATTGTGAAAACTGGC
|
profilin [Ananas comosus]
|
3
|
|
ACSSR25
|
CO730830.1
|
391
|
(GATTA)4
|
59.855
|
GTTCTCCATTGCTTCTCGATCT
|
AGGGCATACTACCATCAACAGG
|
Pineapple green mature fruit cDNA library Ananas comosus cDNA clone
|
4
|
|
ACSSR26
|
DT336115.1
|
397
|
(CCTCTT)3
|
59.581
|
AAGATCGGGTTCATCACTCTTC
|
ACCAAAACAGCATCTATCTGCC
|
unknown protein
|
4
|
|
ACSSR27
|
DV190745.1
|
395
|
(AGAAGC)3
|
59.92
|
TGCAATTCTGTGAGTTCTTCGT
|
GAAACACTGCTCCCTTGTCTCT
|
undiscovered sequence
|
4
|
|
ACSSR29
|
DT337199.1
|
391
|
(CTTCCG)4
|
60.11
|
GATCGGGTTCTTCACTTTTCAG
|
CCTGCACTTTCTTTTGCTTCTT
|
unknown protein
|
3
|
|
ACSSR30
|
DT338688.1
|
387
|
(AGCTCT)3
|
59.778
|
TACACCACCACCTTTTCCTTTT
|
CTTGTTCTCTCCCTCTCCTCCT
|
undiscovered sequence
|
4
|
3 讨论
利用AFLP、RFLP、RAPD、ISSR分子标记技术研究菠萝遗传多样性已有文献报道。例如刘卫国等[12-13]以菠萝叶片为材料，利用AFLP技术分析39个高质量的菠萝分类群的DNA基因组，为菠萝种质资源的评价、分类、利用和选育种提供理论依据。Duval[14]等应用RFLP分子技术和18个同源染色体组探针对菠萝种质资源进行了多样性研究检测。Claudeteet al[15]应用RAPD分子标记对18份菠萝种质进行了分子水平评价。Sergio et al[16]应用RAPD技术和同工酶标记对菠萝种质进行了评价。张如莲[17]利用ISSR分子标记技术对17份菠萝种质进行了基因组DNA多态性分析，根据ISSR扩增结果建立的UPGMA聚类图生物论文，将这17份菠萝种质分成了3类。然而，在菠萝的EST-SSR的信息开发及应用的研究还未见有文献报道。
随着近年来NCBI中EST数据库的完善，EST－SSR作为新一代分子标记展现了广阔的前景中国学术期刊网。各种农作物如水稻[18]、甘蔗[7]、普通小麦[19]、白菜[20]、辣椒[21]，经济林木如白桦[22]、橡胶[3]、麻风树[23]、亚麻[24]、核桃[25]，瓜果类如猕猴桃[26]、花生[27]、苹果[5]、香蕉[28]、西瓜[4]、甜瓜[29]，真菌类如香菇[6]等EST-SSR的开发都取得了可喜进展。本实验通过对菠萝5 659条EST进行SSR筛选，共发现发现636个SSR，分布于617条EST中，SSR占整个EST的11.24%，高于水稻（4.7%）[18]、甘蔗（2.9%）[7]、普通小麦（5.4%）[19]、白菜（10.3%）[20]、辣椒（2.97%）[21]、白桦（10.2%）[22]、麻风树（0.16%）[23]、亚麻（2.73%）[24]、花生（7.8%）[27]、香蕉（5.3%）[28]、西瓜（6.89%）[4]、甜瓜（8.36%）[29]、香菇（2.96%）[6]，略低于橡胶（11.42%）[3]、核桃（10.75%）[25]、猕猴桃（14.08%）[26]。上述差异的原因，一是EST数据库中不同物种间基因的差异导致SSR分布的差异；二是SSR检索的软件和标准不同导致最终筛选结果的差异。经本实验研究所得菠萝的EST中，二、三、六核苷酸是主导类型生物论文，分别占SSR总数的42.61%、29.25%、20.13%。菠萝二核苷酸重复中AG/TC是比较常见的优势基元类型，在亚麻[24]、甜瓜[29]、苹果[5]、花生[27]、黄瓜[2]中也都存在这一规律；而三核苷酸的重复基元比较分散，优势基元AGC/TCG仅占三核苷酸重复类型的13.98%，六核苷酸SSR在总的EST中有128条，而六核苷酸的重复基元有80种，种类虽丰富，数量却不多。
本研究共设计了636对菠萝EST-SSR引物,合成的30对引物中有27对引物有良好的扩增结果，可以预见对剩余引物的筛选有较高成功率地保证。总之，从本研究EST－SSR分析及实验验证结果可以看出，菠萝EST－SSR出现频率高，而且类型丰富。通过本实验的研究将为今后凤梨科植物分类、遗传作图、遗传多样性分析、功能基因定位等方面研究奠定良好基础。
参考文献References：
[1]LIN Chao-zong. The main technical measures Pineapple cultivation[J].Subtropical Plant Research Communications,1987(02):37-40.
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