论文导读:：拓展荧光SSR技术的应用范围。进行多重PCR扩增。板栗群体中含有生态适应性的基因资源。建立群体混和样本中基因频率的分析方法。群体中单株再分别进行基因频率鉴定。
论文关键词：SSR，多重PCR，板栗群体，混和样本，基因频率
中国板栗（Castanea mollissima）是我国特有的壳斗科栗属植物。由于具有坚果品质好、抗逆性强等优点，中国板栗是世界食用栗品种改良的重要基因来源。板栗群体中含有生态适应性的基因资源，是丰富的基因库，对群体的遗传多样性和基因频率分析将为这些材料的利用、进化及其野生近缘种的关系等研究奠定基础[1-4]。每个板栗群体单株混和取样可以较全面地分析群体内的等位基因数、等位基因频率、遗传结构与稀有基因[5-6]；群体遗传多样性分析的群体数目往往较多，群体中单株再分别进行基因频率鉴定，工作量大；而且，群体中的单株也大多是杂合状态SSR，对单株分别进行等位基因鉴定，也未必准确进行基因频率分析。因此，有必要建立一种可以基于混和取样的分析基因频率的方法，以提高分析效率与准确性。
探讨板栗群体遗传多样性分析的取样策略，建立群体混和样本中基因频率的分析方法，是提高分析效率的有效途径[7-9]论文下载。本试验拟采用基于全自动DNA遗传分析仪的SSR荧光标记检测技术，用6-FAM、HEX和NED等荧光染料标记引物，精确分析扩增产物的片段大小和定量扩增终产物丰度。利用ABI全自动遗传分析仪获得混和样本SSR扩增产物丰度数据，用GeneScan与Genotyper软件进行图像、定量分析与数据输出，并探索使用R软件对Genotyper输出的信息进行混和样本等位基因频率分析，提高板栗群体基因频率分析效率与准确性，拓展荧光SSR技术的应用范围。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料选用来自山东、河北、北京、辽宁、江苏、陕西、四川板栗主产区7个省份的17份地方品种，每个群体的采样株数为14～21株（表1）。采样过程中，对于个体数大于20株的群体就按照均匀分布、随机取样的原则进行采样SSR，而对于个体数少于此数的群体进行全部个体采样。本试验所用的普通引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，引物信息除无荧光标记外（表2）。SSR引物的5′端分别用6-FAM、HEX和NED等进行荧光标记。
表1 板栗地方品种的来源与采样数
Table 1 Origin and sample size oflandraces used in the study
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群体编号Populations No.
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名称name
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地理来源Origin
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采样数Sample size
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1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
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西祥沟无花Xixianggou wuhua
新庙野板栗Xinmiao wild chestnut
辽丹58 Liaodan 58
大公书4号Dagongshu 4
东密坞无花Dongmiwu wuhua
燕昌Yanchang
炮车2号Paoche 2
处暑红Chushuhong
官厅10号Guanting 10
柞红栗Zhahongli
燕红Yanhong
遵达栗Zundali
辽丹61Liaodan 61
菜西大油栗Laixi dayouli
大早熟Dazaoshu
短扎Duanzha
上丰Shangfeng
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山东泰安Tai’an, Shandong
山东莒南Junan, Shandong
辽宁宽甸Kuandian, Liaoning
四川广元Guangyuan, Sichuan
河北迁安Qian’an, Hebei
北京昌平Changping, Beijing
江苏新沂Xinyi, Jiangsu
江苏宜兴Yixing, Jiangsu
河北遵化Zunhua, Hebei
陕西柞水Zhashui, Shanxi
北京昌平Changping, Beijing
河北遵化Zunhua, Hebei
辽宁宽甸Kuandian, Lioaning
山东莱西Laixi, Shandong
辽宁凤城Fengcheng, Liaoning
江苏宜兴Yixing, Jiangsu
山东烟台Yantai, Shandong
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15
17
17
23
15
19
19
20
16
24
15
19
25
16
15
14
17
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表2 本试验所用的SSR引物及荧光标记类型
Table 2 The primers used in the studyand the fluorescent labels
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引物Primers
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序列Sequence
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退火温度∕℃ Optimal annealing temperature
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荧光标记Fluorescent label
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CmTCR10
CmTCR21
CmTCR24
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F CACTATTTTATCATGGACGG
R CGAATTGAGAGTTCATACTC
F CGAGGTTGTTGTTCATCATTAC
R GATCTCAAGTCAAAAGGTGTC
F CTGCAAGACAAGAATTACAC
R GAATAACCTGCAGAAGGC
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52
50
60
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无Non
NED
无Non
HEX
无Non
6-FAM
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1.2 方法
 1.2.1 DNA提取
以来自于国家果树种质泰安板栗圃的17个板栗群体为试材，采用混和取样法，从每个群体中选出15个单株，每个单株选取等质量叶片组成1 g混和样本，采用改良的CTAB法[10]提取基因组总DNA。
1.2.2 PCR扩增
PCR扩增总反应体积为25 μL，含2.5 μL 10 × Buffer (100 mmol·L-1Tris-HCl, pH 8.3, 500 mmol·L-1KCl)，2.0 mmol·L-1 MgCl2，各引物0.5 μmol·L-1，250 μmol·L-1 dNTP，1 U Taq DNA 聚合酶和60 ng模板DNA，反应在热循环器MJ Research PTC 100中完成。扩增循环反应：94℃ 5 min；94℃ 50 s，各引物对退火温度45 sSSR，72℃ 90 s，30个循环；72℃延伸7min。不同引物选择适宜的退火温度。
以新庙野板栗群体DNA为模板，选择退火温度相近的荧光引物CmTCR10和CmTCR21，进行多重PCR扩增，这两对引物检测通道的显色分别为蓝色与黑色。PCR体系和扩增程序除引物为两对外，其他的同常规PCR扩增一致。
1.2.3扩增产物变性和荧光检测
96孔板中，分别加入1 μL 6-FAM、2 μL NED、3 μL HEX和22 μL超纯水，5000 r/min离心1 min论文下载。于PCR仪上95℃变性5min，立即置于冰上。在ABI3700DNA分析仪上完成自动荧光检测。
1.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
25 μL PCR样品加入5 μL 6×loading Buffer，混匀后，在95℃变性5min，立即置于冰上。以pBR332/MspⅠ片段为分子量标准。使用Seque-GenaGT电泳系统（Bio-Rad, USA），90 W恒功率电泳约50 min~1.0 h，在6％聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上电泳。
1.2.5数据分析
利用GeneScan和Genotyper软件进行图像分析与数据收集。用GeneScan扫描并分析SSR原始数据SSR，设置分子量内标（Size Standard）和参数（Parameters），读取样品最高峰，统计无峰样品，计算每板样品的通过率（成功率），作为检验与纠正仪器电泳效果的依据。将无峰样品的比例控制在5%以内[11-13]。Genotype软件的Categories、Analysis、Tables菜单中的相关选项对起始片段大小、引物重复类型、域值、输出项目等参数进行设置，建立表格。利用R软件中的FREQS-R模块对Genotyper输出的信息进行分析，计算基因频率。
2 结果与分析
2.2 多重PCR
以新庙野板栗群体的DNA样品为模板，荧光引物CmTCR10和CmTCR21为多重PCR的引物组合，扩增产物在ABI3700上进行检测，在分析数据或读带时，选择不同的显色通道，选择O：内标显红色，选择B：CmTCR10引物5′端NED显蓝色，则显示的图谱为红色内标峰和CmTCR10扩增产物不同等位基因的峰（图2-A）。引物CmTCR21扩增产物仅显示黑色的不同等位基因的峰与红色内标峰（图2-B）。图2-C为图2-A与2-B的合成图谱SSR，结果显示，不同引物扩增产物的区分度良好论文下载。
从Genotyper输出的数据中可提取片段大小、峰高等信息。在新庙野板栗群体中，多重PCR引物组合CmTCR10和CmTCR21的扩增产物区分度良好，没有形成干扰，CmTCR10能扩增出分子量分别为177、189、195、206和212 bp这5个等位基因，CmTCR21则有152、158、167、175、184、189、201、209和215 bp共9个等位基因，两引物的等位基因片段所在区间重叠，根据不同的检测通道，分别读出各等位基因的峰高（表3）。峰高值与扩增终产物的丰度对应，直接与定量及频率换算相关。研究表明，荧光SSR分析结合多重PCR技术能明确区分各等位基因片段和定量，用于分析板栗群体混和样本中等位基因频率确实是可行的。
2.2 等位基因与基因频率的分析
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