菠萝微卫星指纹图谱的构建_SSR

论文导读:：在菠萝的栽培及传播过程中。根据每对SSR引物生成带型间的差别直接对带型进行分类编号。便形成了该品种的分子指纹图谱。
论文关键词：菠萝，SSR，指纹图谱
 

菠萝(Ananas comosus (L.)Merr.), 属菠萝科(Bromeliaceae)、凤梨属(Ananas), 原产南美洲巴西和巴拉圭, 在热带和亚热带地区均有分布。菠萝最早由印第安人传至中南美洲和西印度群岛, 自哥伦布从瓜德罗普岛带至西班牙之后, 在世界各地推广, 覆盖全球70多个国家和地区。菠萝在热带水果生产和贸易中的地位仅次于香蕉和芒果,是中南美洲和亚太地区的重要经济作物之一^[1]。

在菠萝的栽培及传播过程中，由于传播者及当地栽培者的习惯命名不同，各品种的别名特别多，出现了异名或多名的现象，造成了菠萝品种名称混乱的现象，而且各大类群品种的变异性大，这不但阻碍了菠萝种质资源的合理利用SSR，也影响了菠萝的品种改良与育种。

DNA 指纹图谱(DNA fingerp rint) 是指建立在DNA标记基础上的某一品种所具有的区别于其他品种的特异DNA片段。DNA分子标记绘制的品种指纹图谱像人的指纹一样具有个体特异性,能准确、快速鉴定品种或品系,简化了作物育种和种子管理工作论文怎么写。通过图谱可表现与目标性状有关的DNA水平的信息,避免了环境干扰;不受生长发育时间的制约;准确可靠;特别适合从形态上较难鉴定品种。通过检测待测样品是否具有目标品种特有的指纹片段及其比例,可以有效地鉴定种子的纯度、品种的真伪,对种子质量进行监测。另外,通过DNA 指纹的比较可以方便地提供分子水平的直接证据,有利于品种或材料获得专利保护^[2-3]。

微卫星（Simple sequence repeat，SSR）标记是近年来发展起来的建立在PCR扩增（PolymeraseChain Reaction）基础上的分子遗传标记,已被广泛用于玉米^[4]、水稻^[5]、大豆^[6]、小麦^[7]等农作物品种DNA指纹图谱的构建及杂交种子纯度鉴定研究中。国内外有利用AFLP^[8]、ISSR^[9]、RAPD^[10]、RFLP^[11]等分子标记技术对菠萝进行研究的报道,但SSR分子标记技术的应用鲜见报道。

本研究利用，开发的5对SSR引物,构建了31个菠萝SSR指纹图谱,初步建立了一套适用于菠萝种鉴定的SSR技术体系，为菠萝新品种的登记、分类和保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料来源于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所和中国热带农业科学院南亚所，菠萝种质圃保存的种质(表1)。选田间生长健壮、无病虫危害植株的幼嫩叶片，保存于?70℃备用。

表1 实验用植物材料

Plant materials usedfor marker validation

table11中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所（品资所）: Tropical Crops Genetic Resources Institute(TCGRI)

2中国热带农业科学院南亚热带作物研究所（南亚所）：South Subtropical Crop Research Institute （SSCRI）

1.2 DNA提取

DNA提取采用改良的CTAB法^[12]，程序简介如下：取约1g样品，在液氮中研磨成粉末；加5 mL CTAB提取缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0), 5 mmol/L EDTA-Na2 , 0.35 mol/L 葡萄糖, 2% PVP40, 用前加入3% β-巯基乙醇]，离心后弃去上清；加入5 mL 65℃预热CTAB裂解缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),20 mmol/L EDTA-Na2 , 1.4 mol/L NaCl, 2% CTAB, 2% PVP40, 用前加入3% β-巯基乙醇]，摇匀，65℃水浴30-90min；加等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提；上清液用0.6倍体积的异丙醇和1/10体积3 mol/L乙酸钠(pH5.2)沉淀DNA；用无离子水稀释DNA之后用酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)和氯仿：异戊醇(体积比为24：1)抽提纯化；最后用2倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，用TE溶解。所有沉淀都经70％乙醇清洗2-3次。

1.3 PCR扩增和电泳检测

PCR扩增反应体系的总体积为20 μl包括：2 μl的10× PCR buffer，1.6 μl的1.5mM MgCl2，0.25mM dNTPsSSR，5pmol正、反向引物各1 μl，20ng模板DNA，0.15U Taq聚合酶(5 U/μl)；反应程序为：94℃预变性3min，30个循环（94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min），72℃延伸7min。PCR产物的分离用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，1×TBE电泳缓冲液120V恒压电泳1. 5 h，电泳完毕采用银染显色银染检测，观察并照相记录。

1.4 图谱构建方法

借鉴小麦带型记录的新方法^[13]，根据每对SSR引物生成带型间的差别直接对带型进行分类编号，可得到每个品种的带型编号，一个品种的DNA经过不同引物扩增后，将获得一系列带型编号SSR，按照固定的引物顺序，串联各带型编号，形成一组数据，便形成了该品种的分子指纹图谱论文怎么写。

2 结果与分析

2.1 图谱构建

2.1.1SSR标准引物的筛选

应用前期开发的20对菠萝EST-SSR引物，筛选能够扩增出稳定的带型且不同材料之间差异明显的 SSR引物，从中选取了5对多态性高、重复性好、分辨率高的SSR引物对作为标准引物(表2)，以用于构建31份菠萝材料的DNA指纹图谱。

表 2 SSR引物信息表

Table 2 Information of 5 primers

2.1.2标准带谱的建立

针对菠萝SSR带型识别和记录中因带纹繁多和分布复杂而造成带纹判读和记录困难的特点，我们借鉴了小麦SSR带型记录的快捷方法对SSR引物生成带型间的差别直接对带型进行编号建立标准带谱，以有效简化菠萝SSR带型的记录方法。该方法避免了由于错误判断引起的实验误差，并可利用每个品种的带型编号，建立品种(系)的 DNA 指纹。将5个引物依次用英文字母A B C D E表示，每个引物生成的有差别的带型用该引物的字母代号和阿拉伯数字表示。EP-12，13，15SSR，20和24这5个引物可分别将31份供试材料分为6，7，7，7和6组，图1所示为引物EP-12和EP-20的标准带型图谱。

图1 引物EP-12和EP-20的标准带谱

Fig.1 SSR patterns of EP-12 and EP-20

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