论文导读:：菠萝(Ananascomosus)。中大量的植物EST数据为SSR分子标记的开发提供了新的途径[2]。其中以SSR标记在植物遗传研究上应用最为广泛。
论文关键词：菠萝，EST，SSR
菠萝(Ananas comosus)，凤梨科，凤梨属多年生草本果树植物[1]，原产巴西，为热带多年生草本植物，16世纪时传入中国生物论文， 有70多个品种，岭南四大名果之一。菠萝含有大量的果糖，葡萄糖，维生素A、B、C，磷，柠檬酸和蛋白酶等营养物质。其果味甘性温，具有解暑止渴、消食止泻之功，为夏令医食兼优的时令佳果。另外，菠萝皮中富含菠萝酶，有丰富的药用价值，据国外专家20多年实验，长期食用菠萝皮，心脑血管生物论文，糖尿病发病率显著降低，并有一定的抗癌效果。
近年来分子生物学的发展以及各种分子标记技术不断出现，使得植物遗传分析研究得以迅速发展，其中以SSR标记在植物遗传研究上应用最为广泛。随着测序技术成本的降低，GenBank中大量的植物EST数据为SSR分子标记的开发提供了新的途径[2]中国学术期刊网。EST-SSR除具一般SSR分子标记特点外，还有信息量大，通用性好，开发简单、快捷、成本低等[3]的特殊优势。目前许多作物如西瓜[4]、苹果[5]、香菇[6]、甘蔗[7]已开发大量的EST-SSR，并应用于遗传作图、遗传多样性[8]等研究上，但在菠萝栽培种上至今尚未见从EST中开发SSR的相关报道。
本研究对现有菠萝EST中SSR信息进行全面分析，以明确菠萝EST-SSR发生频率和特点，为进一步建立EST-SSR标记并探索其在菠萝研究中的遗传作图、育种材料评价、品种鉴定等的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采集菠萝幼嫩的叶片于-20℃保存。
1.2 菠萝EST的获得及EST-SSR序列查找
从美国国家生物技术中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的植物基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html)共搜索到5659条菠萝的EST序列。应用Websat（http://wsmartins.net/websat/）在线程序搜索EST-SSR。搜索的标准为:二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复序列的重复次数分别大于或等于9、6、5、4和3。
1.3 EST-SSR引物设计
利用Primer Premier 3.0在线程序对包含有SSR的EST设计引物生物论文，引物设计的原则为EST序列长度大于100 bp，SSR序列的开始和结束位置分别距5'和3'端不少于20 bp。引物设计的主要参数为：引物长18~27bp，最适为22bp；引物退火温度Tm值57~60℃，上游与下游引物的Tm值相差±1℃；PCR预期产物长100~400bp；尽量避免引物二聚体，发夹结构和错配等。按重复类型的比例挑选30对引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.4 EST数据冗余分析
利用VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen)及RepeatMasker(http://www.repeatmasker.org)去除载体污染和重复序列,对于那些能设计出引物的EST序列，最后通过Tm值和引物序列比对进一步删除冗余序列。
1.5 DNA提取
采用改良CTAB法[9]提取菠萝的基因组DNA中国学术期刊网。
1.6 PCR扩增、电泳检测
PCR反应体系（25μl)：10×buffer 2.5μl，Mg2+ 25mmol/L 1.5μl， dNTP10mmol/L 0.5μl，引物100μmol/L1μl，Taq酶5.0U 0.2μl，模板DNA 20ng/μl 3μl。
反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，51℃退火40秒生物论文，72℃延伸50秒，38个循环，72℃终延伸7分钟，8℃保存。
PCR产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测，120 V电压电泳1.5 h后，采用银染法染色，BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统中成像。
1.7 SSR位点的功能分析
对筛选出的SSR提取其所在的基因序列，概念性翻译成蛋白质序列后，利用Blastp比对，提取相似性最高的序列注释信息，作为SSR靶向基因的功能注释，并对SSR位点的注释信息进行分类。
2 结果与分析
2.1 菠萝EST-SSR的频率和分布密度
在5 659条EST序列中，经过筛选共发现SSR序列636个生物论文，占整个EST数据库的11.24%，表明菠萝中的EST-SSR十分丰富。经计算去除冗余后的菠萝EST序列总长约为4.7×106bp，菠萝SSR分布密度为平均7.39 kb EST就存在一条SSR(表1)，并且不同重复类型的平均距离有明显差异，EST-SSR出现频率越高其平均距离则越小。菠萝EST-SSR中含有二核苷酸、三核苷酸、四核
苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复的序列分别占EST数据库中发现SSR序列总数的42.61%(271/636)、29.25%(186/636)、3.46%(22/636)、4.56%(29/636)、20.13%(128/636)(表1)，说明菠萝EST-SSR的优势重复单元为二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸，三者共占EST-SSR总数的91.98%。其中二核苷酸重复的出现频率（42.92%）明显高于其他类型，三核苷酸（28.93%）和六核苷酸（20.13%）重复的出现频率也相对较高。重复类型为四核苷酸、五核苷酸的重复所占的比例比较小，只占总SSR的8.02%。
表 1 菠萝中EST-SSR的数量、比例、出现频率与平均距离
Table 1Number,Proprotion,frequency and mean distance of EST-SSR inpineapple
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重复类型
Repeat type
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SSR数量
Number of SSR
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所占总SSR比例/%
Proprotion in all SSRs
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出现频率/%
Frequency
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平均距离/kb
Mean distance
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| |
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二核苷酸Dinucleotide
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271
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42.61%
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4.79%
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17.34
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三核苷酸
Trinucleotide
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186
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29.25%
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3.29%
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25.27
|
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四核苷酸
Tetranucleotide
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22
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3.46%
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0.39%
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213.64
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五核苷酸
Pentanucleotide
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29
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4.56%
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0.51%
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162.07
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六核苷酸
Hexanucleotide
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128
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20.13%
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2.26%
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36.72
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总计Total
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636
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100%
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11.24%
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7.39
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2.2 菠萝EST-SSR的重复类型特点
全部菠萝的EST-SSR中共搜索出174种重复基元，其中二核苷酸重复基元有10种，三核苷酸重复基元有48种，四核苷酸重复基元有15种，五核苷酸重复基元有21种生物论文，六核苷酸重复基元有80种（表2）。在二核苷酸重复基元中AG/TC、GA/CT出现频率最高，在总的SSR中所占比例为23.27%（148/636）、15.88%(101/636)(图1)。而三核苷酸的重复基元中AGA/TCT、AGC/TCG、CAG/GTC、CTC/GAG、CTG/GAC、CTT/GAA的出现次数在10以上，并且其中重复次数最大的AGC/TCG也仅为总SSR的
4.09%（26/636）（图2）中国学术期刊网。统计显示三核苷酸的基元种类相对来说较多，比较分散。六核苷酸的SSR在总的EST中有128条，但六核苷酸的重复基元种类有80种，其中60种重复基元出现1次，其余20种重复基元出现次数在一次以上，在六核苷酸重复基元中CCTCCG出现7次，发生频率仅占总SSR的1.10%。总体而言六核苷酸重复基元总数虽然多，但每一种基元类型出现的频率却不高。而四核苷酸和五核苷酸的重复基元不仅在数量上很少，而且基元分布较平均，未出现优势基元。
菠萝的EST-SSR基元长度分布情况见图3。由于搜索标准严格，将一些兀余序列剔除（特别是一些本身序列较短或者是数据库重复登录的序列）。因此生物论文，EST-SSR的分布不是连续的。菠萝的EST-SSR基元长度分布主要集中在18~36bp之间，其中18bp在总的分布中尤为突出，共有194条，占总数的30.5%。从整体趋势来看，EST-SSR的数量是随着基元长度的增长而减少的。Temnykh等[10]研究发现，SSR基元长度在12 bp以下时为低多态性，长度在12～20 bp之间的SSR为中等多态性，长度大于或等于20 bp时为高多态性。依据以上标准，41.67%菠萝的EST-SSR为中等多态性，58.33%菠萝的EST-SSR则为高多态性。
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