| RNA印迹：参照《分子克隆实验指南(第三版)》。
探针制备：将已确定序列的双链质粒DNA经过碱处理后，用地高辛（DIG）标记RNA探针试剂盒（Roche）分别合成带有DIG标记的探针。具体方法根据说明书。
2.结果与分析：
2.1总RNA的提取
RNA提取后进行甲醛变性胶凝胶电泳(见图1)：有28S和18S两条带，28S的亮度较18S的亮，且A260/A280比值约1.9.因此，本实验所提取的RNA的质量及完整性能进行后续的反转录及杂交实验。
图1：夏橙果皮总RNA的甲醛变性胶电泳
Fig.1TotalRNAseparatedonaagarose-formadehydeagarosegelinValenciaOrangepericarp
2.2RT-PCR产物的扩增、拼接及序列同源性分析
以果皮总RNA为模板，RT-PCR扩增结果显示，扩增的PSY、PDS和ZDS基因产物的cDNA片段长度分别为：504bp、545bp和612bp，分别编码168、181和203个氨基酸与预期的扩增大小相一致。在NCBI中用BLASTP和BLASTX进行序列的同源性比对分析，发现所扩增的夏橙果皮PSY、PDS和ZDS基因cDNA片段与多种物种中相对应的同类基因cDNA序列高度同源。如夏橙PSYcDNA与葡萄柚（ABY86652.1）、番木瓜（ABG72805.1）、果梅（BAF49052.1）的PSY基因同源性分别为99%、92%和91%（图2）。PDS及ZDS基因cDNA片段序列比对也有相似的结果，与其它物种中相应的PDS和ZDScDNA的同源性均在90%以上（图3和图4）。推测克隆的夏橙果皮PSY、PDS和ZDS基因cDNA序列编码夏橙类胡萝卜素合成途径中相应关键酶。
挑出阳性克隆并测序后得到相应的序列，将测得的序列结果通过BLASTP或BLASTX搜索NCBI的核苷酸和蛋白质数据库，进行序列的相似性分析，发现与其它植物的同源性较高。以PSY片段为例，测序的结果翻译成氨基酸序列后，与番木瓜、葡萄柚及果梅进行序列比对（DNAMAN软件），发现同源性达90%以上（见图2）。PDS及ZDS基因片段也有类似的结果（图2-3和图2-4）。进行利用RACR-PCR技术，分别扩增得到PSY、PDS、ZDS基因3’末端，琼脂糖凝胶电泳后得到长度分别约为500bp、1kb和1.2kb的片段；然后据引物设计位置及序列，把得到的3’RACE-PCR产物与相应的片段进行拼接后，就得到相应的PSY、PDS、ZDS基因3’全长；找出翻译区的终止密码子的位置，然后分别设计引物扩增出包含有翻译区及非翻译区的长度约为300bp-500bp的探针片段，并进行DIG标记。
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图22-1夏橙：PSY基因片段的序列比对的结果
1,：番木瓜（ABG72805.1);，2,：葡萄柚（ABY86652.1);，3,：果梅（BAF49052.1);，X,x：夏橙PSY测序结果.
Fig.2：TheresultsofmultiplesequencealigmentonPSYgeneamplifiedfromValenciaOrangepericarp
1,：Caricapapaya;，2,：Citrusparadisi;，3,：Prunusmume;，X,xPSY：deducesequencesequenceofValenciaorange.
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图32-2夏橙：PDS基因片段的序列比对的结果
1,：番木瓜（ABG77271.1);，2,：杏（AAX33347.1);，3,：葡萄柚（AAK5145.1);，X,x：夏橙PDS测序结果.
Fig.2：TheresultsofmultiplesequencealigmentonPDSgeneamplifiedfromValenciaOrangepericarp
1,：Caricapapaya;，2,：Prunusarmeniaca;，3,：Citrusparadisi;，X,x：deducesequencePDSsequenceofValenciaOrange.
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图4夏橙2-3：ZDS基因片段的序列比对的结果
1,：番木瓜（ABG72806.1);，2,：蜜柑（ABC33728.1);，3,：咖啡（ABC87740.1);，Xx,夏橙：ZDS测序结果
Fig.24：TheresultsofmultiplesequencealigmentonZDSgeneamplifiedfromValenciaOrangepericarp
1,：Caricapapaya;，2,：Citrusunshiu;，3,：Coffeacanephora;，X,xZDS：deducessequenceofValenciaOrange.
2.3夏橙PSY、PDS、ZDS基因在NorthernBlotting检测夏橙后期发育进程发育进程在PSY、PDS、ZDS基因在果皮中的表达
分别以克隆的PSY、PDS、ZDS基因3’末端全长为模板，设计特定引物，获得PSY、PDS、ZDS地高辛标记的探针，用于检测3个基因在夏橙发育后期7个阶段（P1-P7）果皮中的表达状况。 2/4 首页 上一页 1 2 3 4 下一页 尾页 |
