外源亚精胺对盐胁迫下黄瓜幼苗游离态多胺含量和多胺合成酶基因表达的影响

论文导读：种子由天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所提供。主要有腐胺、亚精胺和精胺等。全世界超过8亿公顷的土地受到盐胁迫的影响。叶片多胺合成酶基因表达。盐胁迫，外源亚精胺对盐胁迫下黄瓜幼苗游离态多胺含量和多胺合成酶基因表达的影响。
关键词：黄瓜，亚精胺，盐胁迫，多胺合成酶基因
 

土壤盐渍化是影响作物生长发育的主要因素之一，全世界超过8亿公顷的土地受到盐胁迫的影响[1]。高浓度的盐扰乱了植物体内离子的动态平衡，引起渗透胁迫和次生代谢胁迫[2]，导致植物生长受阻、产量下降。植物为了适应和抵抗盐胁迫，体内生理代谢和分子网络发生变化，如K+、Na+等离子的区域化分布[3]，质子泵活性增加[4]，ROS清除能力增强[5]，可溶性蛋白表达增多[6]等；当细胞感受到环境中的Na+时，通过胞内第二信使Ca2+和ABA的信号传导激活SOS基因的表达，调控胞内离子区域化分布抵抗盐胁迫[7]；此外，盐胁迫下植株体内多胺代谢的变化成为抗盐研究热点之一。

多胺是涉及植物逆境胁迫响应的一类小分子物质，主要有腐胺、亚精胺和精胺等，以游离态、结合态和束缚态三种形态存在[8]。多胺的代谢特征之一是植物受到非生物逆境胁迫时，体内多胺合成酶活性改变，同时植物为了适应环境体内多胺含量迅速发生变化。研究表明，盐胁迫、低氧胁迫、温度胁迫、干旱胁迫等均能诱导植物体内游离态多胺发生变化[9]。研究发现，外源Spd能够提高盐胁迫下黄瓜幼苗抗氧化酶活性，降低H2O2及丙二醛的含量[5]，减缓盐胁迫对氮素代谢的伤害[10]，促进Na+、K+离子的区域化分布[3]，提高植株光合能力[11]等缓解盐胁迫伤害。

以往的研究大多从植物生理代谢的变化来说明外源Spd缓解植物盐胁迫伤害的机理，近年来，从分子生物学角度对环境胁迫与多胺合成酶基因表达的研究很多，在拟南芥[12]、马铃薯[13]、玉米[14]、苹果[15]、猕猴桃[16]、可可树[17]等作物上已经报道了胁迫环境下多胺合成酶基因的表达情况。论文大全，盐胁迫。论文大全，盐胁迫。拟南芥的研究表明，盐胁迫下体内多胺含量明显上升，adc、samdc和spms基因表达上调[18]；在烟草和番茄中异源表达adc、odc、samdc、spds基因, 体内多胺含量明显升高，表现出对各种环境胁迫的耐性[19]。盐胁迫下多胺合成基因在模式植物中的表达分析研究较多，而外源Spd对盐胁迫下黄瓜多胺合成酶基因表达的影响未见报道。本试验以黄瓜为材料，研究盐胁迫下外源Spd对黄瓜幼苗游离态多胺含量和多胺合成酶基因表达的影响，探讨外源Spd对内源多胺合成的影响，为深入探讨外源多胺缓解盐胁迫伤害机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1供试材料

试验于2010年3~5月在南京农业大学玻璃温室内进行，供试黄瓜(Cucumissativus L.)品种为盐敏感型的‘津春2号’，种子由天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所提供，选取饱满、整齐一致的种子，55℃温汤浸种，29℃培养箱催芽，将发芽的种子播于装有石英砂的8cm×8cm育苗盘中，昼温25℃~30℃、夜温15℃~18℃。待第3片真叶长出时，挑选生长一致的幼苗定植与营养液水培槽内，营养液采用日本山崎黄瓜配方，PH值为6.5+0.1，EC值为2.2~2.5 ms·cm-1，气泵通气(40min·h-1)。

1.2试验处理

幼苗缓苗3d后开始处理。共设4个处理：(1)CK:正常营养液栽培;(2)CS:正常营养液+叶面喷施1 mmol·L-1Spd;(3)S:正常营养液+75mmol·L-1NaCl;(4)SS:正常营养液+75mmol·L-1NaCl+叶面喷施1 mmol·L-1Spd，CK和S 2个处理分别喷施等量的蒸馏水作为CS和SS对比，喷施方法同CS和SS。盐胁迫处理当天直接将NaCl加入营养液中，使NaCl终浓度为75mmol·L-1。亚精胺(Spd)为SIGMA公司产品，白色固体，配制母液于4℃冰箱保存，使用时稀释到1mmol·L-1，现配现用，处理当天开始到试验结束为止，每天傍晚5:30用小型喷雾器进行叶片喷施，叶面、叶背均匀喷洒，以药液附于叶面但不下滴为准。处理第3天取样，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱中保存备测。

1.3株高、茎粗和干鲜重的测定

处理3d时，用直尺测量植株株高（子叶到生长点间的长度），游标卡尺测定茎粗（子叶下部2/3的粗度）用蒸馏水冲洗干净幼苗，吸干表面水分，分成地上部和地下部，称量鲜重，然后105℃杀青15min，75℃烘24h至恒重，称干重。

1.4游离态多胺含量的测定

多胺含量测定参照段九菊的方法[20]，称取0.5g黄瓜叶片，加入1.6ml预冷的5％HClO4，冰浴研磨，匀浆在4℃放置1h后于12 000r/min离心30min(4℃)。取上清液1ml，加入2mol·L-1 NaOH 2ml和15µl苯甲酰氯原液，涡旋混匀，37℃放置30min后加入2ml饱和NaCl混匀终止反应，再加入3ml乙醚萃取，于3500r/min离心5min，取乙醚相1.5ml吹干后，溶于100µl甲醇，保存在-20℃。去样品20µl用Dionex P680型高压液相色谱分析仪检测。流动相为64％的甲醇，Kromasil反相C18柱(4.6mm×250mm)，检测波长254nm。

1.5RNA提取及RT-PCR

黄瓜叶片RNA用Trizol试剂按说明书提取。参照TAKARA公司AMV反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链。论文大全，盐胁迫。

根据GenBank和黄瓜基因组数据库(cucumber.genomics.org.cn)里的核苷酸序列设计特异性引物，以反转录产物为模板进行中间片段的扩增：94℃ 5min；94℃ 30s；X℃退火30s；72℃ 延伸60s；72℃ 扩展5min；共35个循环，PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 目的基因特异引物序列

Table 1 Designof primers for targeted genes

2 结果与分析

2.1幼苗生长

由表2可知，正常条件下喷施Spd对黄瓜幼苗生长无显著影响；盐胁迫抑制了黄瓜幼苗的生长，株高、茎粗、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重、根干重和全株干重相比对照分别下降了36.67％、21.21％、42.09％、27.05％、33.07％、33.33％、49.50％；而盐胁迫喷施Spd后，黄瓜幼苗株高、茎粗、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重、根干重和全株干重分别提高了28.81％、9.61％、40.02％、16.45％、38.82％、18.75％、35.64％。

表2 外源Spd对盐胁迫下黄瓜幼苗生长的影响

Table 2 Effect ofexogenous Spd on growth of cucumber seedlings under salt stress

图中不同小写字母表示同期处理间差异达5％显著水平，下同

Different normal letters among the same times oftreatment mean significant difference at 5％ level. Thesame as below

2.2叶片游离态多胺含量

由图1可知，在正常栽培条件下，外源喷施Spd对植株体内游离态Put、Spd、Spm含量无显著影响；盐胁迫使游离态Put、Spd、Spm含量显著升高，与对照相比分别升高了178.41％、47.31％、22.51％；盐胁迫下喷施Spd后体内游离态Put降低了31.53％，而游离态Spd和Spm提高了31.90％、29.14％。表明盐胁迫可促进黄瓜体内多胺含量增加，而外源Spd进一步提高了盐胁迫下游离态Spd和Spm的含量，降低了Put的含量。

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