中国野生华东葡萄抗白粉病相关基因pUSP的克隆及功能分析-论文网

2.4中国野生华东葡萄VpUSP基因诱导表达分析

对中国野生华东葡萄半定量实验表明，未接种叶片中，VpUSP基因有少量表达。VpUSP基因在抗病华东葡萄株系白河-35-1，“6-12-6”，白河-13-1中受白粉病的诱导表达，侵染白粉病48h后表达量达到高峰，随后逐渐降低。而VpUSP基因的表达在感病华东葡萄株系白河-35-2，“6-12-2”，广西-2中并无明显变化(图6)。以上结果表明，VpUSP基因的转录在抗病葡萄株系白河-35-1，“6-12-6”，白河-13-1中受白粉病的诱导，对白粉病处理的响应时间在48h时达到高峰，说明VpUSP可能参与了抗病华东葡萄株系抗白粉病的过程。

AB

CD

EF

图6葡萄白粉病诱导华东葡萄株系VpUSP基因表达的RT-PCR分析

GAPDH为内参基因；

A-F白河-35-1；白河-35-2；白河-13-1；广西-2；6-12-6；6-12-2;

Fig6RT-PCRanalysisoftheexpressionofVpUSPinVitispseudoreticulatainresponsetoUncinulanecatorSchw.Burr.

GAPDHisActin；

A-FBAIHE-35-1；BAIHE-35-2；BAIHE-13-1；GUANGXI-2；6-12-6；6-12-2

3.讨论

本研究从接种白粉菌的抗病华东葡萄中获得一个与胁迫相关基因，通过NCBI网站的核酸、蛋白比对及进化分析及其他植物USP相关基因的报道中推测，该基因属于USP基因家族。

USP蛋白在古生菌，细菌，植物中均被发现，但不存在于动物中。USPA蛋白在埃希氏菌属大肠杆菌细胞生长受到限制，DNA被损坏时诱导表达；该蛋白在化学毒素，渗透胁迫，UV照射条件下调节细胞中的营养物质；被认为外界压力的生物传感器。在埃希氏菌属大肠杆菌细胞中发现，USPA与细胞分裂蛋白有协同作用，同时可激活Rec-A的表达，RecA蛋白是细菌中参与DNA同源重组修复的重要蛋白，增强细胞抗性。RecA蛋白和Rad51蛋白分别是细菌和真核生物参与DNA同源重组修复的重要蛋白。我们所克隆到的VpUSP基因能被葡萄白粉病菌所诱导，表明其具有参与胁迫调控的功能，至于其是否通过激活Rad51的表达增强细胞抗性还需要进一步研究。

近年来,对USP基因的研究主要集中在干旱，水分等非生物胁迫诱导方面。在多种植物中研究表明，在植物受到胁迫时，USP相关基因表达量会明显上调，可增强植物的抗逆性。GUSP1和GUSP2在水分胁迫下木本棉中诱导表达，HSPCB基因在高水分胁迫情况下有益于棉花的生长，ER6基因在番茄成熟过程中被诱导，在果实形成不同时期，表达量随着时间的变化而不同，在果实变为红色时，表达量达到高峰；OsUsp1基因在深水性水稻受到高水分胁迫1h后被强烈诱导表达，并且视为分子调节基因。

对于USP基因在植物生物胁迫方面的研究尚无相关报道。我们结合cDNA文库及RACE技术，在中国野生华东葡萄高抗白粉病株系白河-35-1中，筛选得到一条与胁迫相关的USP基因，利用半定量PCR技术对其在葡萄抗病过程中的表达方式进行研究。

我们选择了华东葡萄中3个抗病株系和感病株系分别进行研究，发现VpUSP基因在未受生物胁迫的6个株系中均有表达，抗病株系表达量极其微弱，但在感病株系表达方式非常独特，其表达水平始终比较强，前人研究结果表明，USP基因是一种诱导型基因，因此在感病株系中的独特表达方式还有待进一步研究。

在抗病株系中，接种白粉病菌后VpUSP基因表达量随着接种时间的延长而增强，在48h达到表达峰值，而后下降。这就表明VpUSP基因在抗病株系中属诱导性表达基因，其参与了中国野生华东葡萄的抗病诱导。在抗病葡萄中，这种表达方式与非生物胁迫在诱导条件下的表达是相符的。但在感病株系中，接种白粉病菌后，表达量变化不明显，表明VpUSP基因属组成型表达基因，不参与抗病诱导。这与前人对于非生物胁迫的研究结果截然相反。

4.结论

利用RACE,RT-PCR方法，首次分离出一个受病原菌诱导的中国野生华东葡萄白河-35-1VpUSP基因的全长cDNA序列。VpUSP基因转录表达水平在白粉病菌侵染华东葡萄抗病株系48h后表达达到高峰，这表明VpUSP参与了中国野生华东葡萄抗白粉病的过程。

参考文献
1 HE Pu-chao,WANG Yue-jin,WANG Guo-ying, REN Zhi-bang,HE Chun-cheng. The studies on the disease-resistance of Vitis wild species originated in China[J]. Scientia Agricultura Sinica,1991, 24(3): 50-56.
2 WANG Yue-ijn,HE Pu-chao.Study on inheritance of resistance to powdery mildew in Chinese native wild Vitis L [J] . Scientia Agriculture Sinica, 1997, 30 (1) :19 - 25.
3 ZHANG Jian-xia, WANG Yue-jin, XU Yan. The Resistance of Chinese Wild Vitis to Unicinula necator and Its Inheritance of F1 Generation.Scientia Agriculture Sinica. 2001,34(6):610-614.
4 Nystrom T , Neidhardt FC. Cloning, mapping and nucleotide sequencingof a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli. Mol Microbiol,1992,6(31):87–98.
5 Nystrom T, Neidhardt FC. Isolation and properties of a mutant of Escherichia coli with an insertional inactivation of the uspA gene, which encodes a universal stress protein. [J]. Bacteriol., 1993, 175(39):49–56.
6 Nystrom T, Neidhardt FC. Expression and role of the universal stress protein, UspA, of Escherichia coli during growth arrest [J]. Mol Microbiol. 1994,11(5): 37–44.
7 Margret Sauter, Guillaume Rzewuski, Tanja Marwedel Rene Lorbiecke. The novel ethylene-regulated gene OsUsp1 from rice encodes a member of a plant protein family related to prokaryotic universal stress proteins[J]. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 2325-2331
8 ZHU Zi-guo,WANG Yue-jin,SHI Jiang-li,WANG Pei-ya, ZHANG Chao-hong.Constructiom of cDNA library of Vitis pseudoreticulata hybrid with resistance to powdery mildew and analysis of express sequence tags[J]. Journal of Fruit Seience .2009,26(1): 151-157
9 Zhang Jin-jin,Wang Yue-jin,Wang Xi-ping,Yang Ke-qiang,Yang Jin-xiao.An Improved Method Rapidly Extracting Total RNA from Vitis[J].Journal of Fruit Science.2003,20(3):178-181
10 Nystrom T, Neidhardt FC. Effects of overproducing the universal stress protein UspA, in Escherichia coli K-12.[J] Bacteriol.1996,178:927–30
11 Gustavsson N., Diez A. A., Nystrm T. The universal stress protein paralogues of Escherichia coli are coordinately regulated and cooperate in the defence against DNA damage[J]. Molecular Microbiology 2002, 43(1): 107–117
12 Vollmer Cheng Amy,Dyk Van Tina K. Stress Responsive Bacteria: Biosensors as Environmental Monitors[C]//ROBERT K POOLE. Advance in Microbial Physiology,Department of Biology.Swarthmore College.500 College Aventue. Swarthmore,PA 19081.USA,DuPort Central Reasearch and Development,Experiment Station E173/216,P.O.Box 80173,Wilmington.DE 19880-0173.USA. 49:131-169
13 Alfredo Diez, Niklas Gustavsson ,Thomas Nystrm. The universal stress protein A of Escherichia coli is required for resistance to DNA damaging agents and is
14 Tian Bin.Genetic Analysis of radA Gene in Sulfolobus Islandicus[D]Wu Han:Hua Zhong Agricultural University,2009
15 Asma Maqbool,Muzna Zahur,Tayyab Husnain,Shiekh Riazuddin.GUSP1 and GUSP2, Two Drought-Responsive Genes in Gossypium arboreum Have Homology to Universal Stress Proteins[J]. Plant Mol Biol Rep 2009,27:109–114
16 Voloudakis AE, Kosmas SA, Tsakas S, Eliopoulos E , Loukas M, Kosmidou. Expression of selected drought related genes and physiological response of Greek cotton varieties[J]. Functional Plant Biol, 2002,29(10):1237–1245.
17 Zegzouti H, Jones B, Frasse P, Maitre C, Latch A, Pech JC,M Bouzayen. Ethylene-regulated gene expression in tomato fruit:characterization of novel ethylene responsive and ripening-related genes isolated by differential display[J].Plant J,1999,18(6):589–600.

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