| 取10μl的PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,观察PCR灰度，从而获得该基因的表达特征。
2.结果与分析
2.1中国野生华东葡萄RNA的提取
采用改进的SDS/酚法提取出样品RNA（图1），28S和18S条带清晰，亮度和宽度均为2∶1，表明所提取的RNA完整，没有降解。紫外分光光度计检测结果D/D为1.8～2.0，RNA纯度高，没有多酚和蛋白的污染，可以用于反转录实验。
图1总RNA提取
Fig.1ExtractionoftotalRNA
2.2中国野生华东葡萄VpUSP基因全长序列的获得
以接种0、6、12、24、48、72、96hRNA等量混合为模板，根据Clontech公司RACE试剂盒说明书要求进行RACE-PCR（图2），获得180bp的5'端序列和900bp的3'端序列，利用DNAstar软件进行拼接获得836bp的全长序列。
图2VpUSPcDNA片段的RACE-PCR产物凝胶电泳
M：DL2005：5′RACE扩增产物，3：3′RECA扩增产物
Fig.2.ElectrophoresisofRACE-PCRproductofVpUSPcDNAfragments
M,DNAmarkerDL2000;5,5'RACE-PCRproduct;3,3'RACE-PCRproduct.
2.3中国野生华东葡萄VpUSP基因序列的生物信息学分析
13atggagagtgagccaactcggataatgatcgcagtgaacgagtcg
MESEPTRIMIAVNES
58agcatcaagggctatccacacccctctattagcagcaagcgcgcc
SIKGYPHPSISSKRA
103ttcgaatggactcttcagaagatcgttcgctccaacacctctgcc
FEWTLQKIVRSNTSA
148ttcaagctcctcttccttcacgtccatgtccccgacgaagacggt
FKLLFLHVHVPDEDG
193tttgatgacatggatagcatttatgcatcccctgaagatttcaaa
FDDMDSIYASPEDFK
238aacttggagcgcagggacaaggcaagagggcttcaattgttggag
NLERRDKARGLQLLE
283cactttgtgaagagttcttatgaatttggggtttcttgtggagca
HFVKSSYEFGVSCGA
328tggataaagaaaggtgatcccaaggaagtcatatgccatgaggtc
WIKKGDPKEVICHEV
373aaacgaatccagccagatttactggttgtgggttgcaggggtctt
KRIQPDLLVVGCRGL
418ggcccttttcagagggtttttgttggaactgtgagtgaattttgt
GPFQRVFVGTVSEFC
463gtgaagcatgctgaatgccctgtcatcaccatcaaacgcaggcca
VKHAECPVITIKRRP
508gatgaaattcctcaggacccagttgatgactga540
DEIPQDPVDD*
图3VpUSP基因cDNA及推测的氨基酸序列
Fig3SequencesofVpUSPcDNAanditsdeducedaminoacids
图4VpUSP与其他USP基因的系统进化树分析
Fig4PhylogenetictreeofVpUSPandotherUSPgens
 
图5VpUSP蛋白的三维结构示意图
Fig.5Theinalthree-dimensionstructureofVpUSP
VpUSP基因全长836bp，开放阅读框为528bp，编码176个氨基酸（图3），通过NCBI网站Blastx分析：中国野生葡萄VpUSP基因编码的氨基酸序列与Arabidopsisthaliana（NP_196972）﹑Arabidopsisthaliana（NP_566140）﹑Brassicarapa（ABV89649）等基因编码的USP蛋白的氨基酸序列一致性分别为133/175(76%)﹑126/175(72%)﹑128/175(73%)；通过DNAStar的进化树分析（图4），中国野生葡萄VpUSP基因与Arabidopsisthaliana、Brassicarapa的USP基因有着很高的相似性。通过SWISS-MODLE得到VpUSP蛋白结构模型（图5），显示该蛋白由4个 -螺旋和5个中心的 -折叠组成，与Arabidopsisthaliana（NP_566140）的蛋白结构相似。 2/3 首页 上一页 1 2 3 下一页 尾页 |
