小麦EST-SSR标记对几种有潜力禾本科能源植物的可转移性研究

Table 3 Transferability of wheat EST-SSR markers to 7 grassenergy plant species

2．2 引物的多态性

在36对可转移性引物中，Xcwem1、Xcwem3、Xcwem7和Xcwem35等4对引物在这7个物种中只产生了一条与小麦CS对照一致的条带，无多态性。其余32对引物均能扩增出多态性条带，占所有引物的67%，占可转移引物的89%。其中6对引物（Xcwem6, Xcwem9, Xcwem11,Xcwem32, Xcwem36, Xcwem 50）可扩增出一条多态性条带，5对引物（Xcwem22生物论文，Xcwem40，Xcwem43，Xcwem44，Xcwem47）可扩增出2条多态性条带，4对引物（Xcwem17，Xcwem34，Xcwem42，Xcwem46）可扩增出3条多态性条带，6对引物（Xcwem2，Xcwem15，Xcwem20，Xcwem39，Xcwem45，Xcwem56），2对引物（Xcwem38，Xcwem49）可扩增出5条多态性条带,2对引物（Xcwem12，Xcwem55）可扩增出6条多态性条带，4对引物（Xcwem16，Xcwem41生物论文，Xcwem52，Xcwem54）可扩增出7条多态性条带，2对引物（Xcwem51，Xcwem53）可扩增出8条多态性条带，1对引物（Xcwem57）可扩增出9条多态性条带。

由32对引物在7个物种中扩增出的多态性条带，从Xcwem6等6个引物的1条到Xcwem57的9条，显示了不同引物检测这7个禾本科植物多态性差异的能力不同。扩增条带分布情况列于表4。

表4 小麦EST-SSR标记在7种禾本科能源植物中的多态性

Table 4 Polymorphism of wheat EST-SSR markers in 7 grassenergy plant species

2．3 遗传多样性

36对可转移小麦EST-SSR引物在7种禾本科能源植物中共检测出240个位点，其中多态性位点为184个，多态位点百分率高达76.67%。每位点等位基因数是描述多态性的一个重要参数，本研究中每个位点等位基因数为1.7667条，有效等位基因数为1.4557。每个位点的PIC变幅为0-0.37，平均为0.22。

Shannon指数在群体遗传学中提供了非常重要的信息，它解释了等位基因的丰度及均匀度。而Nei’s指数是另外一个揭示群体遗传多样性的重要参数。本研究中Shannon指数为0.4106，Nei’s指数为0.2728，表明这7种禾本科潜在能源植物间的变异度较高，遗传多样性较丰富。

小麦可转移EST-SSR标记反映的7种禾本科能源植物间遗传多样性较高，但各标记揭示物种间遗传多样性的能力差异较大，如Xcwem43在7个物种中十分保守，扩增单一条带；而Xcwem16则检测到多个位点生物论文，揭示了较丰富的遗传多样性（图1）论文参考文献格式。

a,引物Xcwem43的扩增效果；b,引物Xcwem16的扩增效果。图中A、B、C、D、E、F、G和CS泳道分别代表斑茅，中国芒，五节芒，河八王，南荻，菅，香根草和小麦等禾本科物种。

a, PCR amplificationprofile of Xcwem43； b, PCRamplification of Xcwem16. A、B、C、D、E、F、G and CS lane represent Saccharumarundinaceum，Miscanthussinensis，Miscanthusfloridulus, Narengaporphyrocoma，Triarrhena lutarioriparia，Themeda villosa，Vetiveria zizanioides and Triticumaestivum，respectively.

图1 小麦EST-SSR引物对禾本科能源植物的PCR扩增效果

Fig.1 PCR Amplificationprofile of energy grass plants using wheat EST-SSR primer pairs

2.4 进化关系分析

利用可转移的36对引物所检测出的240个位点资料，构建了7种禾本科能源植物及小麦的系统树。结果表明，遗传相似系数变异范围为0.51-0.76。以0.66为阈值，可将7种禾本科植物与小麦明显分开；以0.68为阈值，可将7个供试物种分为3组（图2）。斑茅、河八王、南荻及菅被聚为A组，斑茅为甘蔗属物种，而河八王和南荻均为甘蔗近缘种^[7]生物论文，由于菅的相关文献较少，没有找到将其聚入A组的依据。B组为中国芒和五节芒，二者同为芒属，遗传相似系数最高，为0.76，这在一定程度上说明了该聚类的可靠性。香根草被单独聚入C组，据中国植物志描述，香根草须根含香精油，具挥发性浓郁紫罗兰香气，且茎秆中空，这与其它6个物种有很大差别，因而单独聚为一组。

图2 基于可转移小麦EST-SSR标记的7种禾本科能源植物的系统图

Fig.2 Dendrogram of 7 energy grass plants based ontransferable wheat EST-SSR markers

3讨论与展望

3.1 EST-SSR分子标记可转移性的意义

小麦作为世界上主要的粮食作物，基因组学资源较为丰富。而斑茅、中国芒、五节芒、河八王、南荻、菅和香根草等均为野生草种，目前人工利用较少，遗传学和基因组学研究资源十分匮乏，但具有巨大的潜在的开发价值。利用已有小麦基因组学资源对这些草种进行研究既经济又省时省力。

SSR引物的可转移性在许多物种中均有报道，如Kuleung等人研究了小麦、大麦、黑小麦等谷物间的SSR可转移性,发现小麦的SSR引物对大麦和黑小麦的可转移率为16.9%和57.4%，大麦的SSR引物对小麦和黑麦的可转移率为42.9%和39.3%^[17]。Varshney等人研究发现，大麦EST-SSR引物对小麦、黑麦和水稻的可转移率分别为78.2%、75.2%和42.4%^[18]；对于芒属植物的分子标记遗传多样性也有报道生物论文，如Hernández等利用玉米的SSR和RFLP对芒属植物进行研究，结果表明所用15个玉米RFLP探针均能与芒草DNA成功杂交，玉米SSR对芒草DNA有效扩增率达75%^[19]。

EST-SSR属于表达序列，比基因组SSR具有更高的保守性，因而也拥有了更高的可转移性。 李宏伟等研究了小麦EST-SSR在玉米、水稻、大豆中的通用性，根据小麦EST设计的597对EST-SSR 引物在小麦、玉米、水稻和大豆中的有效扩增比率分别为80%、65.8%、62.1%和58.1%^[20]。陈树林等利用陆地棉EST-SSR在陆地棉和向日葵品种中进行了通用性研究，结果同样表明陆地棉EST-SSR在向日葵中有较高的通用性^[21]论文参考文献格式。

还有许多学者通过实验比较了基因组SSR与EST-SSR引物对同一物种的可转移性及多态性。宿俊吉等进行了小麦SSR与EST-SSR对冰草的通用性研究，表明普通小麦EST-SSR和SSR经筛选虽都能转用于冰草，但两者相比EST-SSR更优^[22]。Garcia-Moreno等人比较了向日葵非编码基因组SSR和来源于表达基因的SSR对红花的可转移性，发现表达基因内SSR可转移性为基因组SSR的3倍^[23]；Gutierrez等人发现在豆科植物中EST-SSR引物可转移性为非编码基因组SSR的2倍^[24]。

本实验采用小麦EST-SSR引物对7种禾本科潜在能源植物进行了研究，结果表明，48对引物中36对引物可成功转移，可转移率达75%。并且这些可转移性引物所揭示的物种间遗传多样性较丰富，对于这7种禾本科潜在能源植物的进一步遗传学研究，如遗传多样性评价，遗传图谱构建及分子育种都具有重要意义。

3．2基于小麦可转移EST-SSR标记的种间关系分析

引物在不同物种中的可转移性一定程度上反映了物种间亲缘关系的远近，也即物种间的相似性。Tang等人研究发现，小麦EST-SSR引物对大麦（86.8%）、水稻（77%）和玉米（68.3%）的可转移性随着其种系关系距离的增加而降低^[25]。Zhang 等人研究表明面包小麦EST-SSR引物对黑麦、大麦、冰草及水稻的可转移性分别为67.9%、55.8%、50.4%、和28.3%，也与其进化关系较为一致^[9]。本研究中生物论文，小麦EST-SSR引物对7个物种的可转移性差异不大，可转移引物数的差别仅0-5个，因此，不能仅从可转移引物数及百分率来准确反映小麦与这7个物种间的进化关系。

但是，利用可转移的小麦EST-SSR引物所检测出的位点数为依据，进行聚类分析，却得到了较为可靠的种系发生关系。从图2可以看出，小麦被明显区分开，而7个野生草种也被较合理地聚为三个群组，A组为甘蔗属或其近缘物种，B组为芒属，C组为金须茅属的香根草。这表明，利用可转移性引物能够较好地对所研究物种进行种系关系分析，对于生物进化、物种亲缘关系鉴定都有一定意义。

3．3 本研究的局限性与展望

对种质资源进行遗传多样性分析，要求所有标记能够均匀地覆盖整个基因组^[26]。本研究所选用的48对小麦EST-SSR引物分布于小麦的21条染色体上，每条染色体上分布1-8对引物。由于这些引物大部分是多位点的，因此同一条染色体上标记分布的均匀性未能准确把握，这是后续研究需要改进的地方。

本研究旨在检测小麦EST-SSR的可转移性，对PCR产物条带大小分析要求并不严格生物论文，而聚丙烯酰胺凝胶电泳较复杂，因此采用了3%的琼脂糖凝胶电泳论文参考文献格式。目的条带应在100-500bp范围内，但实际结果中出现了500-1500bp的条带。可能原因是：①供试禾本科能源植物与小麦在进化过程中出现了基因位点的部分突变，导致引物与靶序列不完全互补；②由于循环次数较多或退火温度过低，导致出现了非特异性条带，另外酶量过多也会产生非特异性条带。因此，PCR条件需要在后续实验中进一步优化摸索。

随着人类对能源物质的需求不断加大，加之人类对环境状况的关注度加大，作为可再生且环保的能源植物的研究势必越来越受到重视。要有效地利用和保护遗传资源，关键环节是对所收集材料中可能存在的遗传变异进行评估，而分子基因分型（molecular genotyping）技术的应用将会对种质评估发挥极大的推动作用。EST-SSR这类新型分子标记来源于基因的表达区，因而用于种质遗传分析，包括品质鉴定、遗传多样性研究、系统进化关系推测以及遗传连锁图谱绘制，已被应用于甘蔗、玉米、大麦、小麦、葡萄等物种中^[20]。本研究分析了48对小麦EST-SSR引物对7种禾本科潜在能源植物的可转移性，得到了75%的高转移率，并对这7种潜在能源植物进行了初步的系统学分析。充分利用现有的小麦基因组学资源，开拓性地开展了对这7种处于野生状态的、科学研究背景资料稀少很少的物种的研究，筛选出了一批优良的分子标记，为今后这些禾本科能源植物的分子遗传与育种提供了有益的借鉴。

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