论文导读:：设置小麦品种中国春（CS）作为SSR扩增对照。分子标记可转移性的意义。等人研究了橄榄SSR标记对洋橄榄的可转移性[13]。构建了7种禾本科能源植物及小麦的系统树。
论文关键词：小麦，EST-SSR分子标记，可转移性，禾本科能源植物
能源问题是21世纪人类面临的严峻挑战之一[1]。随着社会与经济的发展，中国对能源的需求将会不断增加。植物能源是地球贮藏太阳能的一种形式，也是化石能源形成的前体，在太阳能、核能的大规模应用开发之前，植物能源是从化石能源到太阳能过渡期间的、能够进行大规模开发利用的可再生资源之一。生物燃料属于植物能源，是以生物质为载体的能源，直接或间接地来源于植物的光合作用。地球上的植物通过光合作用每年生产的生物燃料量，相当于目前人类每年消耗矿物能的20倍。因此，生物燃料的开发生物论文，将是人类利用可再生能源的主要途径[2]。
高大禾本科植物是最易获得、生产力高、储量丰富的木质纤维生物质之一，作为转化燃料乙醇的原料潜力巨大。以“能源草”作为生物质能源的原材料成本低、效率高，不占用耕地，可利用山坡边际土地，兼具水土保持的功效论文参考文献格式。燃烧后产生的污染物也很少，可有效减轻温室效应、降低环境污染。因此开发高产优质的禾本科能源植物已经成为当前生物质能研究的一个热点[3]。
斑茅(Saccharum arundinaceum)又名大密、笆茅、大巴茅，是甘蔗属多年生、密丛高大草本，秆直立，高可达4米以上，茎达2厘米，具有分蘖力强、根系发达、抗旱性强等特性[3]。中国芒（Miscanthus sinensis）、五节芒（Miscanthus floridulus）均为禾本科芒属植物，具有生长迅速、适应性强，种植成本低、利用率高等多种优势。目前，欧美多国已开始大面积种植芒属植物并大规模研究其作为能源作物的开发利用价值[2,4,5]。南荻（Triarrhena lutarioriparia Liu)是原产我国长江流域、伴生于芦苇丛中的高大草本植物，植物学分类归属禾本科荻属，具有水土保持、固堤防洪、净化水体和空气、维护自然生态系统等作用[6]。河八王(Saccharum arundinaceum)为甘蔗的杂交亲本[7]，菅（Themeda villosa）及香根草（Vetiveriazizanioides）也曾作为水土保持及优良薪炭草种[8]。然而，这些禾本科植物均处于野生状态，遗传学研究报道极少生物论文，基因组资源极其匮乏，限制了该类植物的遗传改良。因此，借助现代分子遗传与育种学方法对其进行研究改良，培育适宜于大规模生产栽培的能源植物新品种，对于促进这些野生战略资源植物的开发利用，服务于国家经济建设具有重要意义。
SSR(Simple Sequence Repeats)即简单重复序列，又称微卫星(Microsatellites)DNA，是一种由1-6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，同一类微卫星DNA分布在基因组的不同位置上，由于SSR重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性[9]。EST-SSR来源于表达的基因片段，作为功能基因的一部分，具有很高的保守性，且可直接用于基因组作图和基因发掘，尤其可以用于比较基因组学研究[10]。SSR分子标记被证明是现今最可靠实用的DNA分子标记之一，已广泛应用于农作物的基因组学和遗传育种学研究。但是，根据传统方法,开发新的SSR分子标记费时费力且价格昂贵[11]。目前，SSR标记的通用性已被不少研究者证明，如Garcia-Moreno等人研究了向日葵SSR标记对红花的可转移性[12]生物论文，Rallo等人研究了橄榄SSR标记对洋橄榄的可转移性[13]，Wang等人研究了红豆SSR引物对绿豆的可转移性[14]。
因此，借助与这几类草本植物亲缘关系较近、基因组学研究相对较为深入的、同属禾本科的小麦EST-SSR引物序列，开发可用于中国芒等野生能源植物的SSR分子标记，将大大地降低开发成本、提高实验效率。本研究旨在探测小麦EST-SSR引物对这几种有潜力禾本科能源植物的可转移性，开发出可靠的SSR分子标记，为这些能源植物的遗传育种研究奠定基础论文参考文献格式。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1 植物样品
植物样品选用了中国科学院武汉植物园采集保存的、均属禾本科的7种多年生草本植物。其中斑茅为甘蔗属，中国芒和五节芒为芒属，河八王为河八王属，南荻为荻属，菅为菅属，香根草为金须茅属植物（表1）。于10月上旬采样，采集新鲜幼嫩叶片约2g，放入装有50g无水硅胶的密封袋中瞬时干燥，随后放入-20℃冰箱保存。另外，设置小麦品种中国春（CS）作为SSR扩增对照。
表1 供试的禾本科植物
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编号
Code
|
名种
Species
|
拉丁名
Latin name
|
染色体数
Chromosome number
|
染色体倍数
Chromosome ploidy
|
|
A
|
斑茅
|
Saccharum arundinaceum
|
60
|
2X
|
|
B
|
中国芒
|
Miscanthus sinensis
|
38
|
2X
|
|
C
|
五节芒
|
Miscanthus floridulus
|
38
|
2X
|
|
D
|
河八王
|
Narenga porphyrocoma
|
30
|
2X
|
|
E
|
南荻
|
Triarrhena lutarioriparia
|
38
|
2X
|
|
F
|
菅
|
Themeda villosa
|
20
|
2X
|
|
G
|
香根草
|
Vetiveria zizanioides
|
20
|
2X
|
|
CS
|
小麦
|
Triticum aestivum
|
42
|
6X
|
The grass plant species examined in this study
table1
1.1.2 EST-SSR引物信息
本研究中，选用了Peng与Lapitan（2005）开发出的48对小麦EST-SSR引物。这些EST-SSR标记覆盖了小麦全基因组，包括所有21条染色体和42个染色体臂[15],引物序列等信息列于表2。
表2 本研究中采用的小麦EST-SSR引物信息
Table 2 Wheat EST-SSRprimers used in the present study
|
引物编号
Primer-code
|
引物序列
Primer sequence
|
SSR结构
SSR motif
|
退火温度（℃）
Annealing tem
|
|
Xcwem1
|
L：CCGTCGTCAGTTCAAATGG
R：TCCAGGAATGGGTTTACTGC
|
(CAG)5
|
50
|
|
Xcwem2
|
L：GGAAGAACAAGGGCAATGG
R：CGGCACCCTGATGTCCTC
|
(GGC)5
|
50
|
|
Xcwem3
|
L：GATCTGTGACCGAGGCAGA
R：GCTGTGGAGGTCCAAAATGT
|
(AC)7
|
55
|
|
Xcwem4
|
L：CTACCCGCCGCAGCTCTAC
R：GGTTCTTGAAGTCGGTGGTG
|
(GCA)5
|
50
|
|
Xcwem5
|
L：CTCCCTCTGCCCCTCTTG
R：CAGCTCGCCTGTATCCATCT
|
(AGC)6
|
55
|
|
Xcwem6
|
L：CCTGCTCTGCCATTACTTGG
R：TGCACCTCCATCTCCTTCTT
|
(AG)12
|
55
|
|
Xcwem7
|
L：ACGGCGTGTTGAGTTTTTCT
R：CAACTGCAACAACAAAACAGT
|
(T)10
|
55
|
|
Xcwem8
|
L：TGTGCTTCAAGCCTCAAGTG
R：GCTCGCACTCGAGTACACTG
|
(TAC)5
|
55
|
|
Xcwem9
|
L：CACCATCACCGAGATCCAA
R：GGAGCTCCTCCACCTTGTC
|
(CAGG)5
|
55
|
|
Xcwem10
|
L：GAACATTTTTGCGTCCTGTG
R：TGGTGATCCAGAAGCCATTT
|
(A)11
|
50
|
|
Xcwem11
|
L：CAGAGCAACCAGATGTTGGA
R：TGCACGTAGTAGTAGGCACCTC
|
(ACT)5
|
60
|
|
Xcwem12
|
L：CAGCAACCATTACCACCACA
R：GCGAAAATGATGGTTGTTGA
|
(ACA)5
|
60
|
|
Xcwem13
|
L：GGTGCAGAACTCATGTGGAA
R：GTTCGGAGAACCGACTGAAG
|
(GCT)5
|
55
|
|
Xcwem14
|
L：GGCGTTCGGACGTTATATGT
R：GACATCCGAGCAGCTAAACC
|
(CTT)6
|
55
|
|
Xcwem15
|
L：AGAGGAAGCCATCCAATCTG
R：TCTTACCCTCCCTCGAGTCC
|
(CAG)5
|
60
|
|
Xcwem16
|
L：CCGCCGCCTCCTCTACTC
R：GACGTTTCGGCGCATAGA
|
(CGC)5
|
55
|
|
Xcwem17
|
L：GCGATGACTTCGGACAGG
R：AAGAGCACCGTCTTGGTCTG
|
(GCG)6
|
55
|
|
Xcwem18
|
L：TTCGCGAAGCGACTACCG
R：GCATCCTTCGTCTCGCTAAC
|
(CGC)6
|
50
|
|
Xcwem19
|
L：ACAAATACAAGCCCCCAAAG
R：GCGGTGGGAAGGTTTCTTAT
|
(GCA)5
|
50
|
|
Xcwem20
|
L：GACACCTTCTCTTGCTCCAAA
R：GAAGACGTGATCAGCATGGA
|
(TTG)5
|
50
|
|
Xcwem22
|
L：TCTGGATCCCTTGTCGAATC
R：GAGGCGAGGATCTCATGGTA
|
(AGC)6
|
55
|
|
Xcwem25
|
L：CGCCTCAGAGCTCTTCACC
R：AAGATACGGTCCGTGTAGGAG
|
(CCG)5
|
55
|
|
Xcwem29
|
L：TTGCCCAGGGAATGAAGTAG
R：TCGTAAACGACTTGAACATTGC
|
(GAT)5
|
50
|
|
Xcwem32
|
L：ATGCTCAAGCCGAGGAAGTA
R：TAGACGCCAACAAAGCCACT
|
(TGC)8
|
55
|
|
Xcwem34
|
L：TTGCACCTTTTGATCCAACC
R：TTGCCTCACCAGACTCAGTG
|
(AAG)5
|
50
|
|
Xcwem35
|
L：CAACATACAGCACCGAGAAAG
R：CAGCTGGAACTCGCTGAAGT
|
(TCC)5
|
55
|
|
Xcwem36
|
L：TCACCGGAATAGGAATAGGG
R：GGTATGGGGATAAAGCAGCA
|
(CGC)9
|
50
|
|
Xcwem37
|
L：GGCAGAAGAGTTGTGGTTGAG
R：TCCTGCTTTGCTTTGATGTG
|
(GAT)5
|
55
|
|
Xcwem38
|
L：AAGCCAAGCGTTAGCTGTCT
R：AGCTCGTTGATCTCCTCGTC
|
(AG)6
|
60
|
|
Xcwem39
|
L：TATTCTTGCGCACCGAGAC
R：AGAAGACGAACCGGACCTG
|
(AGG)5
|
55
|
|
Xcwem40
|
L：TAGCACCAGGCTTGACCAGT
R：GGACCAAAGCCAAAAACAAA
|
(TCT)6
|
55
|
|
Xcwem41
|
L：GGATGGAGAGGGACTTCCTG
R：ACTCCTCCTCCCCCAAAGTA
|
(GCA)8
|
50
|
|
Xcwem42
|
L：ACATCCTGGCGGAGAAGTC
R：TGGAGAGGTCCTGGTAGGTC
|
(CGG)5
|
55
|
|
Xcwem43
|
L：CGTGAAGGGGGACTGTATTT
R：AGCAAGCGGTTGAATATTGG
|
(CATG)5
|
55
|
|
Xcwem44
|
L：AGTGCACTGCAAACACAGAG
R：AGCCGTACACCTTCATAGGC
|
(GAA)9
|
60
|
|
Xcwem45
|
L：TGCAAGACATGCACACTGAA
R：ATTCCCAACAGTGCTGATCC
|
(TGC)6
|
55
|
|
Xcwem46
|
L：ACGTTGTCTCCGTGTCATTG
R：GGTCATGGCCTCAGTCTCA
|
(TCC)5
|
50
|
|
Xcwem47
|
L：CCTTCTCGACTCCCTCTTCG
R：CCATTGCTCGTGGACCTGT
|
(AGG)5
|
55
|
|
Xcwem48
|
L：TCTGTTGTCGGCATTTCAGT
R：TGGCGTTACATTCATTTGGA
|
(TGT)5
|
55
|
|
Xcwem49
|
L：GAGGAGGACTCCATCGTCTT
R：GCTTCCCGAACGAAGAACT
|
(GCC)6
|
55
|
|
Xcwem50
|
L：AGTACTACGGAGCCGAGCAA
R：ATCGAATCGCCGAACATAAA
|
(CTG)5
|
50
|
|
Xcwem51
|
L：CGACAAGAACAAAGCCTGAG
R：CCTCTATCGCGCTGTTGATT
|
(CCAT)6
|
55
|
|
Xcwem52
|
L：CCTACCTACGACGCAAGTCC
R：AGCGAGCAGAAAGCATCAAG
|
(GCAA
AC)5
|
55
|
|
Xcwem53
|
L：ACGCACGCTCGCTTCAAT
R：GCAGTATCGTCTCCCTCTGC
|
(CCG)5
|
55
|
|
Xcwem54
|
L：AGCCAAAGGAGCTGGAGGAC
R：GGCTCCGTGCTCCTCGAC
|
(CCG)5
|
55
|
|
Xcwem55
|
L：CCAAAACCCTGACCTGACC
R：GGAACGTCCTTGAAGACGAG
|
(CCG)6
|
50
|
|
Xcwem56
|
L：CCAAGTGTCAGCAACAAGCA
R：TAGACGAACACGCTGTGGTG
|
(CCG)6
|
55
|
|
Xcwem57
|
L：CCGTACGCCACCAATTTTAC
R：CTGATCCAGAACTCCATCTGC
|
(TC)8
|
55
|
1．2 研究方法
1．2．1 DNA提取方法
基因组DNA提取方法：采用改进的SDS法[16]。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其提取质量与含量，并根据带型亮度与标准浓度梯度（λDNA）比较确定其浓度生物论文，之后稀释至20ng/μL作为PCR工作液待用。
1.2.2 PCR反应和SSR分析
PCR反应体系及反应程序均与Peng[16]一致。反应体系为25μL，其中包括：5μL的DNA模板（20ng/μL），3.75μL灭菌去离子水，2.5μL10×PCR Buffer，1.5μLMgcl2(25mM)，2.5μLPVP（10%），2.5μLBSA(1%)，5μL的dNTPs（1mM），1.25μL的EST-SSR左右混合引物，1UTap酶。
PCR反应在BIO-RAD公司的MyCyclerPCR仪上进行，PCR程序为：94℃3min预变性，45个循环(94℃1 min，每秒降0.6℃，适宜退火温度1min，每秒升0.6℃，72℃延伸2min)，72℃延伸10min。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。
1.2.3 数据分析
有带记为“1”，无带记为“0”。数据结果利用Office excel表格及Popgene32及Ntsys2.10进行分析生物论文，构建进化树。
2研究结果
2.1 小麦EST-SSR引物可转移率
研究发现，在48对小麦EST-SSR引物中，12对引物未能产生扩增条带，它们分别是Xcwem4、Xcwem5、Xcwem8、Xcwem10、Xcwem13、Xcwem14、Xcwem18、Xcwem19、Xcwem25、Xcwem29、Xcwem37和Xcwem48。
除上述12对引物外，共有36对引物可在这7个物种中稳定扩增出条带，可转移率达到了75%论文参考文献格式。在可转移的36对引物中，有27对引物在每个物种中均有扩增条带，占全部引物的56。.25%，占可转移引物的75%。这些引物在各个物种中的可转移数及可转移率见表3。其中，小麦EST-SSR引物对香根草和河八王的可转移率最高，达到了73%，对斑茅、中国芒和五节芒的可转移率居中，对南荻和菅的可转移率最低，为63%。
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