dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

论文导读:：接种番木瓜环斑病毒。研究CP基因发夹RNA的沉默效果。使之表达可诱发RNAi的双链RNA。短片断的核酸序列也能够起到高效抗病性。
论文关键词：番木瓜环斑病毒，CP基因，RNAi，抗病性，渗透法
 

番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是影响番木瓜产业的最重要的一种病毒，由它导致的番木瓜环斑病毒病（Papaya ringspot disease，PRSD）是一种分布最广、危害最严重的番木瓜病害，现已成为制约番木瓜生产的一种世界性的严重病害。传统的一些抗病毒的策略往往收效甚微。随着植物基因工程的发展，以外壳蛋白基因介导的抗病性研究为防治植物病毒病带来了新的途径（郭兴启等，2004，Tougou et al. 2006）。随着科学技术的发展和对PRSV的深入研究生物论文，以基因工程为主要研究手段的番木瓜抗病毒研究显示出巨大的潜力。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是多种生物体内由双链RNA介导的同源mRNA降解现象。植物体天然的RNAi系统并不能起到完全或较高水平地抵御某种病毒侵染的作用。如果人为地将某种病毒的某一序列设计成双链结构，导入植物体，使之表达可诱发RNAi的双链RNA，通过诱导的RNAi，强化植物体内天然的RNAi抗病毒机制，就有可能获得较高抗性的转基因植物。dsRNA介导的抗病性是近来发现并得到广泛应用的一种有效策略。由于dsRNA介导的抗病性具有一些无可比拟的优点(如单拷贝也能产生高抗的转基因植株；短片断的核酸序列也能够起到高效抗病性；入侵的病毒，其RNA会迅速被降解，不需要转入的病毒基因表达产生蛋白质产物等)，使得这种抗病毒的策略具有广阔的应用价值(Voinnet，2001)。（此段是根据编辑修改意见而补充的内容）

Eamens et al.（2008）利用大豆矮化病毒（Soybean dwarf virus SDV）CP[微软用户1]基因构建的hpRNA转化大豆胚状体，转基因T2代植物仍保持病毒抗性论文参考文献格式。竺晓平等，（2006）利用马铃薯 Y 病毒脉坏死株系外壳蛋白（CP）基因的hpRNA表达载体转化烟草，正向重复转基因植株不表现抗病，而反向重复（IR）结构的转基因植株表现高度抗性。因此，研究CP基因发夹RNA的沉默效果，对于番木瓜的抗病毒研究有着重要的意义。

众多研究表明：转CP基因植物的抗病性一般可以得到稳定遗传生物论文，而且具有较小的潜在危险性，被认为是最有应用潜力的途径之一。主要原因如下：第一，外壳蛋白基因在转基因植物中可以得到稳定遗传；第二，对具有特异性抵抗病毒的能力，对亲缘关系较远的病毒不具有抗性；第三，抗病能力与转基因植物体内的蛋白产物的表达量成正比。

虽然CP基因介导的抗病性已经获得了很大的成功，但是仍存在一些问题：一是CP基因介导的抗病性主要表现在病毒侵染的早期，表现在只是延迟发病，当存在高接种量或重复接种时则会破坏其抗性；二是利用CP基因介导的抗病性具有潜在的危险性，因为外壳蛋白对其它病毒的包壳作用可能会导致非蚜传病毒变为蚜传病毒（Hammond et al，1980）。因此，研究人员担心导入的基因可能与植物基因重组导致产生新的病毒。

（此段是根据编辑修改意见而补充的内容）

目前，已成功应用的病毒来源的基因介导的抗性主要包括外壳蛋白基因（Zrachya et al. 2007）、复制酶基因（Sanford et al，1985；Palukaitiset al，1984）、移动蛋白基因和病毒核酸等（庞俊兰，2002）。同时由于在植物中诱发RNAi沉默过程能有效抵御病毒的入侵，因此构建病毒基因的反向重复结构并将其导入到受体材料中生物论文，能够获得高抗该病毒的植株（Waterhouse et al，2002）。

本研究将实验室已经构建好的含有CP基因的反向重复表达载体进行了模式植物烟草和拟南芥的遗传转化，并利用渗透法建立了番木瓜的农杆菌瞬时表达体系。同时对转化植株进行攻毒实验，监测转基因植物的抗病性以及抗病机制。比较PRSV病毒在其寄主植物和非寄主植物上RNAi效应的差异。通过强化植物体的RNAi抗病效应，为培育抗PRSV的番木瓜品种提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料和试剂

拟南芥（Arabidopsis thaliana）：哥伦比亚0号由华中农业大学胡春根教授提供；烟草（Nicotiana tabacum）：k236由华中农业大学陈守文教授提供；番木瓜‘夏威夷’（CaricapapayaL.）：；大肠杆菌（Escherichia coli）菌株：DH5α；根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株：GV3101；质粒：pHellsgate12-CP_IR(简称pHG12-CP_IR) （结构如图1）均由国家果树脱毒种质资源室内保存中心脱毒研究室提供。转化pHG12-CP_IR的烟草植株由本研究室硕士生王莉转化，作者进一步通过组织培养继代培养而成（此句补充后，更准确地解释材料的来源）。感染番木瓜环斑病毒的番木瓜病叶样品由广东省农业科学院果树研究所提供。

'夷cifulltobacoo and PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，植物RNA提取TrizolReagent购自Invitrogn公司，RT-PCR试剂盒购自北京Bio Dev生物技术有限公司，其他常用试剂为国产分析纯。番木番CP基因P5、P4和T2引物序列根据文献（姜玲等，2008）中测定的序列合成。NPTⅡ基因的引物根据pBI121载体序列合成。ACTIN _Nt、ACTIN_Pa和ACTIN_At基因的引物根据文献（代晓燕等，2008）合成（表1）。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成论文参考文献格式。

图1．pHellsgate₁₂-CP_IR干涉表达载体示意图

Fig.1．Sketch map of pHellsgate₁₂-CP_IRinterference expression vector

表1 应用在本项研究中的PCR引物及序列

Table 1 PCR primers and their sequences usedin this study

1.2 方法

1.2.1 植物总 RNA 的提取 总RNA的提取参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行，RNA于-70℃保存。操作在超净工作台上进行，试剂用 DEPC 水配制。

1.2.2 植株接种番木瓜环斑病毒 根据文献（魏军亚，2006，Valentineetal., 2005）并做适当改进：取含有番木瓜环斑病毒的番木瓜叶样适量，按照1：10（w/v）的比例加入PBS磷酸缓冲液生物论文，充分研磨。将匀浆液加入到1.5 mL离心管中，6000 rpm，4℃冷冻离心10 min。冰上放置，取上清液作为病毒接种液。选取4～6叶期的健康植株，在叶正面撒上少量石英砂，由叶脉向叶尖顺势轻轻摩擦整个叶片表面。而后滴加接种液并将接种液在叶片表面涂抹均匀。接种液固定为10 μL，接种结束后立即用蒸馏水冲洗接种叶表面。同时设置不接种任何液体（CK）和接种PBS缓冲液两种对照处理。将接种后的植株移入温室中培养，适当时间后观察表型变化并做分析。

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