dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

2.4 转基因和野生型植株接种PRSV的症状变化

从烟草接种试验可以看出，pHG12-CP_IR转基因植株接种PRSV后的表现症状与野生型植株相比表型无明显的差异，黄化症状苗各占15.1%和15.8%。接种PRSV后，番木瓜瞬时转化植株的顶生新叶表现皱缩，表现枯斑症状的植株比例为10.3%，转化农杆菌GV3101的对照有79.0%表现病症，而野生型植株有90.0%表现病症。拟南芥接种试验显示：接种PRSV后，转基因植株表现症状和野生型表现症状的植株分别占65.0%和24.5%，统计分析显示其差异显著 (p<0.05)。从形态上看，转基因番木瓜和转基因拟南芥植株在病原浸染后，出现不正常叶片的比例显著下降。

表2　转基因植物接种PRSV病原后的形态变化分析

Table2 Analysis of modalitycharacteristic in

transgenic plantafter inoculated by PRSV pathogen

3 讨论

农杆菌介导的基因瞬时表达体系是一种简单、有效且快速的分析基因表达的研究方法。这种方法的优势是不需要产生转基因的植株就能够生产许多需要的异源蛋白质(Fischer生物论文，1999；2004；Hom，2004)。这种瞬时表达体系常常被用来鉴定一些未知的抑制RNA沉默的抑制子或是一些未知基因的功能分析等(Qu，2003；Thomas，2003)。基因瞬时表达体系相比于稳定表达具有很多方面优点，其中最大的优点就是简便且易于操作。

牛颜冰等(2004)发现，如果瞬时表达黄瓜花叶病毒复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的融合基因的dsRNA能够有效阻止相关病毒的侵染。赵明敏等(2006)发现瞬时表达TMV外壳蛋白基因的dsRNA能够影响TMV的侵染。上述研究结果都表明，在植物体内表达dsRNA都能够引起相关基因的沉默。农杆菌介导的基因瞬时表达体系是一种简单、有效且快速的分析基因表达的研究方法。

在本研究中，利用瞬时表达dsRNA的反向重复载体接种番木瓜来降解PRSV的RNA。通过含有PRSV的汁液摩擦接种经过农杆菌浸润的番木瓜子叶表明，经过农杆菌浸润的植株对PRSV的侵染产生了抗性，我们认为这是由于在番木瓜体内导入了由反向重复载体转录形成的dsRNA启动了RNA沉默机制的结果，即瞬时表达CP基因反向重复载体能够形成的dsRNA，从而有效抑制了PRSV对番木瓜植株的侵染。本试验的结果与前人的研究表现出相似的效果（赵明敏等，2006，邱初等，2010）。另外，利用农杆菌瞬时表达体系能将重组的载体快速导入到植株的细胞中去，这样可以快速检测所构建的重组载体是否具有对病毒的侵染产生干扰的能力生物论文，从而可以快速预测所构建的重组载体是否具有抗病毒的沉默效果。为转基因植株的稳定表达提供一定的理论依据。在经农杆菌浸润后的番木瓜子叶上接种病毒，未接种反向重复载体的番木瓜体内，PRSV病毒会由子叶传递到真叶上，说明PRSV能够在番木瓜上进行转移；而接种反向重复载体的番木瓜体内，PRSV病毒不会由子叶传递到真叶上。说明农杆菌瞬时表达体系在番木瓜上得到了运用并且浸润植株体内已启动了RNAi机制抑制了CP 基因的表达。

在进行基因功能分析时，常常会用到模式植物作为转基因受体材料，因为模式植物的转化系统相对成熟，容易得到转基因植株，但对其进行病毒接种试验时，往往会受到病原寄主范围的影响论文参考文献格式。在本试验中，番木瓜PRSV在接种到烟草、拟南芥和番木瓜上时，就表现出寄主和非寄主植物的差别。番木番环斑病毒属于马铃薯Y病毒科Potyviridea，马铃薯Y病毒属Potyvirus，该病毒的寄主范围窄，PRSV-P可自然侵染番木瓜和葫芦，用实验方法可传给藜科和葫芦科的15种双子叶植物，PRSV-W能够侵染葫芦科11个属和藜科两个属的38种植物（Yeh　et al生物论文，1985）。由于烟草本身不是PRSV的寄主植物，在PRSV浸染下，烟草表现的症状明显没有在拟南芥和番木瓜上敏感。可能烟草植株自身产生免疫机制或自身具有较强的忍耐力，因而在表型上变化不大。采用番木瓜作转化受体，受病毒浸染时，形态特征更明显。但在mRNA水平上分析，番木瓜，烟草和拟南芥均表现出phRNA介导的沉默效应。因此，观察RNAi的效果，要从形态特征和分子不同的角度进行综合分析。

依赖真空渗透的瞬时表达系统是1997年由Kapila等人发展完善的，该表达系统外源蛋白3～5天即能获得高水平的表达，周期短，无环境安全性问题，操作容易，设备简单,目前利用农杆菌真空渗透法已在植物中表达了许多外源蛋白(Olivier et al., 2003, Valentine et al., 2005, Wang et al., 2002) 。李玉玺等（2007）研究指出，用农杆菌真空渗透法在烟草中瞬时表达人酸性成纤维细胞生长因子在真空渗透后4天，外源基因获得最高水平的表达。因此，基因瞬时表达的高峰是有规律可寻的。

因此，本研究为快速验证phRNA的沉默效果提供了可借鉴的方法。同时也为建立有效的番木瓜抗病毒基因工程提供了的依据。

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