dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

1.2.4 农杆菌渗入试验参考文献（魏军亚，2006）并做适当改进：挑取含有pHG12-CP_IR载体的农杆菌GV3101单菌落于ΨB液体培养基（含100 mg/L Rif，100 mg/L Spec）中，28 ℃摇床培养至对数生长期生物论文，离心收集菌体。将菌体重悬于含10mmol/L MgCl₂，10 mmol/L 2-(N-吗琳)-乙基磺酸（MES，pH5.6）和150 μmol/L乙酰丁香酮（AS）的缓冲液中。调整菌液浓度使其OD₆₀₀在1.0左右，室温静止放置2-3 h。用1 mL注射器针头将5-6叶期番木瓜的两片子叶下表皮轻轻刺2～3个孔，并在破处用无针头的注射器针管靠压力将菌液注入番木瓜子叶中，同时以GV3101空载体和不经浸润的番木瓜作为对照。每种处理接种6-7株苗，重复3次论文参考文献格式。将不同处理番木瓜幼苗置于28℃和16 h光照/8h黑暗条件下培养。4 d后进行攻毒试验。

1.2.5 拟南芥遗传转化参考文献（Clough and Bent，1998）并做适当改进。选取长势良好且已抽薹的拟南芥植株，除去已开的花和荚，转化前一夜浇足水。挑取含有pHG12-CP_IR载体的农杆菌GV3101单菌落于含有相应抗生素的ΨB培养基中（含100 μg/mL Rif和100 μg/mL Spec），28 ℃摇床培养过夜。取1 mL菌液加入到50 mL ΨB培养基中，28 ℃摇床至OD₆₀₀在1.2-1.6之间。菌液在6000 rpm下离心5 min。倒去上清后用MS渗透培养基重悬菌体至OD₆₀₀约为0.8。侵染之前加入0.5‰的silwet-77并充分混匀。将植株顶端部分全部浸入菌液中，侵染10-15 s。将侵染后的植株避光过夜，第二天转入正常生长环境下。每隔3 d左右重复侵染一次，共重复3次。3-5周后收取种子做筛选。

选取5-6叶期的“夏威夷”番木瓜实生苗作为试验对象，对子叶进行含有目的载体的农杆菌瞬时表达实验，同时设置不接种农杆菌、接种农杆菌GV3101和接种农杆菌pHG12-CP_IR－GV3101三个处理间对照生物论文，每个处理进行6－7个生物学重复。农杆菌接种处理完后的番木瓜植株进行保湿处理，在接种农杆菌4 d后对子叶进行攻毒试验，接种番木瓜环斑病毒，在接种病毒7 d后对子叶上部的顶生新叶进行症状观察并作分析。在烟草上，对5-6叶期时的pHG12-CP_IR转基因烟草和野生型烟草进行攻毒试验。同时设置不接种任何液体（CK）和接种PBS缓冲液两种对照处理。保证接种病毒的操作一致并保证6-7个生物学重复。在拟南芥上，选取播种30 d的pHG12－2 T2代纯合阳性苗和野生型拟南芥的轮状叶进行攻毒试验，接种方法同烟草。同时设置不接种任何液体（CK）和接种PBS缓冲液两种对照处理论文参考文献格式。7 d后观察表型并作分析。选取代表性的植株进行照相。

2 结果

2.1 pHG12-CP_IR转基因烟草的抗病毒分析

接种3 d后观察表型并提取RNA做分析（图2）。表型结果显示处理对照组之间，接种叶并无明显表型差异（见图3a和3b，表2,）。但RT-PCR结果显示，野生型烟草和转pHG12-CP_IR基因烟草在接种PRSV病毒后差异明显，野生型烟草中有高浓度的病毒CP mRNA的积累；而转pHG12-CP_IR基因烟草中几乎没有病毒CP mRNA的积累，可以推测转pHG12-CP_IR基因烟草中已启动RNAi机制抑制了CP 基因的表达（图3）。

图2．烟草叶片总RNA变性凝胶电泳

Fig.2．Denaturing gel electrophoresis oftotal RNA from tobacco leaves

1、3、5．分别为野生型烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片提取的总RNA；2、4、6．分别为转pHG12-CP_IR转基因烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片提取的总RNA。

1、3、5．The total RNA of WT tobacco leaves notinoculated，inoculated with PBS and inoculated with PRSV；2、4、6．The total RNA of pHG12-CP_IR transformed tobacco leavesnot inoculated，inoculated with PBS and inoculated withPRSV．

图3．病原接种后的表现及RT-PCR检测烟草接种叶片中PRSV CP基因的表达

Fig.3．Symptom afterinoculation of PRSV and RT-PCR detection of CP gene expression of PRSVin inoculated tobacco leaves

Up: a, transgenic tobaccoplant inoculationwith PRSV. b, wild plant inoculation with PRSV. Down: 1、3、5．分别为野生型烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片；2、4、6．分别为pHG12-CP_IR转基因烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片。ACTIN为内参基因。

1、3、5．WT tobacco leaves not inoculated，inoculatedwith PBS and inoculated with PRSV；2、4、6．pHG12-CP_IR transformedtobacco leaves not inoculated，inoculated with PBS andinoculated with PRSV．The ACTIN gene was used asthe internal control．

2.2农杆菌介导的番木瓜瞬时表达体系的抗病毒分析

结果发现：未接种PRSV的所有处理无明显表型变化，说明阴性对照良好。而不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101和接种农杆菌pHG12-CP_IR－GV3101在接种PRSV后表型差异明显生物论文，前二者顶生新叶产生明显的枯斑且叶片有皱缩、褪绿的现象，而后者和阴性对照相比无明显表型变化，数据统计结果见表2。约有90%的野生型植株在接种PRSV病原之后，表现出黄化、枯萎和扭曲的症状，而转化植株表现正常（图4a和4b）。RT-PCR结果显示，不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101和接种农杆菌pHG12-CP_IR－GV3101在接种PRSV后差异明显，不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101的番木瓜体内有高浓度的病毒CP mRNA的积累；而接种农杆菌pHG12-CP_IR－GV3101的番木瓜体内几乎没有病毒CP mRNA的积累，说明接种农杆菌pHG12-CP_IR－GV3101的番木瓜体内已启动RNAi机制抑制了CP 基因的表达（图4）。

照

图4．病原接种后的表现及RT-PCR检测番木瓜顶生新叶中PRSVCP基因的表达

Fig.4． Symptomafter inoculation of PRSV inoculation of PRSV and RT-PCR detection of CPgene expression of PRSV in papaya apicillary leaves

Up:上：a, 转基因番木瓜接种PRSV病原. b, 野生型植株接种PRSV病原.　下：1、4、7．分别为子叶不接种农杆菌后未接种、接种PBS和接种PRSV的顶生叶片；2、5、8．分别为子叶接种农杆菌GV3101后未接种、接种PBS和接种PRSV的顶生叶片；3、6、9．分别为子叶接种农杆菌pHG12-CP_IR－GV3101后未接种、接种PBS和接种PRSV的顶生叶片。ACTIN为内参基因。

a, transgenicpapaya plant PRSV. b, wild plant inoculation of PRSV. Down:1、4、7．The RT-PCRdetection of papaya apicillary leaves not inoculated，inoculated withPBS and inoculated with PRSV without inoculated with Agrobacterium；2、5、8．papayaapicillary leaves not inoculated，inoculated with PBS and inoculated withPRSV after inoculated with Agrobacterium GV3101；3、6、9． papayaapicillary leaves not inoculated，inoculated with PBS and inoculated withPRSV after inoculated with Agrobacterium pHG12-CP_IR－GV3101．The ACTINgene was used as the internal control．

2.3 pHG12-CP_IR转基因拟南芥的抗病毒分析

对上部非接种轮状叶进行表型观察发现：未接种PRSV的非接种轮状叶无明显表型差异，说明阴性对照良好。而接种了PRSV的野生型拟南芥的非接种轮状叶相比对照有叶片变黄的特征，而接种了PRSV的转基因拟南芥的非接种轮状叶相比对照无明显表型变化，数据统计结果见表2。RT-PCR结果显示，野生型拟南芥和转pHG12-CP_IR基因拟南芥在接种PRSV病毒后差异明显，野生型拟南芥中有高浓度的病毒CP mRNA的积累；而转pHG12-CP_IR基因拟南芥中几乎没有病毒CP mRNA的积累，说明转pHG12-CP_IR基因拟南芥中已启动RNAi机制抑制了CP 基因的表达（图5）。

植株的接种试验反应出不任是稳定转化的转基因烟草和拟南芥生物论文，还是农杆菌介导的pHG12-CP_IR瞬时表达的番木瓜转化苗，在接种PRSV病原的情况下，从分子水平分析，转化植株都表现出了明显的沉默效果。

图5．病原接种后的表现及RT-PCR检测拟南芥非接种轮状叶中PRSV病毒CP基因的表达

Fig5．Symptom after inoculation of PRSV and RT-PCR detection of CP gene expression of PRSVin uninoculated arabidopsis rosette leaveslf

上：a, 转基因拟南芥接种PRSV病原. b, 野生型植株接种PRSV病原. 下：1、3、5．分别为野生型拟南芥未接种、接种PBS和接种PRSV的非接种轮状叶；2、4、6．分别为转pHG12-CP_IR基因拟南芥未接种、接种PBS和接种PRSV的非接种轮状叶。ACTIN为内参基因论文参考文献格式。

 2/3   首页 上一页 1 2 3 下一页 尾页