论文导读:：通过利用水、酶、酒精3种不同介质，分别对绣球花的芽和茎段样品进行萃取，利用HPLC对样品中的葡萄糖、蔗糖、果糖进行测定分析。结果显示：相同植株的相同处理下，还原性可溶性糖与非还原性可溶性糖的处理结果间存在差异；酒精提取法与酶解提取法具有较一致的结果。综合操作方法等因素，酶解法是利用HPLC进行绣球花属（Hydrangea macrophyllaser.）植物糖测定的最适宜的样品提取方法，其次为酒精提取法。
论文关键词：绣球花属植物，可溶性糖测定，HPLC，3种提取方法
可溶性糖的含量变化不仅影响到果实的品质，其与植物的抗逆性也有着重要的联系[1]。Johs Bak Henriksena 1961年试验显示小麦幼苗中糖含量与抗寒性有密切关系[2] 。王孝宣等1998年对番茄6个不同耐寒性品种的可溶性糖含量测定表明，低温下可溶性糖的含量与品种的耐寒性呈显著或极显著正相关[3]。范月仙等以9个不同抗冷级别的棉花幼苗为材料，经低温处理后测定可溶性糖含量变化，结果显示同一抗冷级别的不同品种的可溶性糖的平均提高率与抗冷性成明显的正相关 [4]。
可溶性糖测定方法通常有滴定法、蒽酮法、高液相色谱法（HPLC）、气象色谱法（G C）等。由于利用HPLC（High-performance liquid chromatography）进行测定分析可以较快捷、准确地获得试验结果，因此越来越多地被应用到蔬菜、果树等农作物的可溶性糖含量的测定中 [5] [6]。而在生物样品测试中，样品处理后内含物的提取方法和提取条件的选择是分析方法研究的重要内容之一，它与分析方法的选择性、精密度和回收率紧密相关[7]。对于利用HPLC测定中的样品提取方法比较的研究报道较少。Xiaoqi Zhang等1999年对碳水化合提取方法比较试验结果表明，不同提取方法下蛋白质的含量变化达到8-50%，存在很大差异[8]。晏桂敏等对山茱萸中马钱苷含量测定的样品预处理方法进行了比较[9]。宋瑾等[6]2007年利用HPLC对葡萄中可溶性糖进行的测定中，在参考Shiraishi (1993) [10]的方法上对提取方法稍微进行了改进。
本研究参考Dale Smith[11的实验方法，通过采用酶解（Enzyme Extraction）、酸萃取（Acid Extraction）、水解（Water Extraction）3种不同方法对样品进行了提取农业论文，利用HPLC对绣球花的芽及茎段进行了可溶性糖提取方法的比较试验，以找到适宜利用HPLC进行可溶性糖分析实验中样品提取方法，对园艺植物抗寒性研究中内含物质的测定具有参考价值。
1、材料与方法
1.1材料准备
试验材料来自丹麦奥胡斯大学园艺系Aarslev研究中心，样品分别于2010年取自经不同低温处理的绣球花茎段，分别取芽及节间部分（3cm左右）经高温干燥处理后备用。
选取10个不同低温处理的样品，分别用剪刀先将茎段及较大的芽体做初步破碎，放入2ml的Eppendorf管(微量离心管)中，经RETSH MM200台式高速振荡器充分研磨。研磨设置频率及时间分别为：芽20F，3M；茎25F,10M。取充分研磨后的样品分别进行称重。
芽：每参试样品3种处理，每处理2次重复，每处理10mg干物质。茎：每参试样品3种处理，每处理1次重复，每处理25mg干物质。
1.2处理方法
1.2.1 水解法
将每个Eppendorf管中加入0.5ml去离子水，经涡旋使干物质与水充分混合后，放置于100水浴锅中煮沸30min，期间需注意防止小管盖子鼓胀开，导致液体溢出或蒸发而使液样流失。
煮沸后的样品凉至室温后，放入离心机中离心5min.（5000rpm），收集上清液后将剩余干物质重复2次进行上述操作。最后将3次收集的上清液再次进行涡旋后，提取0.75ml和等量去离子水混合最后1.5ml的液体经过0.45um滤膜过滤后(也可以在稀释前才进行过滤)进行 HPLC分析。如不能即使进行分析，则储存在-80°冰箱内。
1.2.2酶解法
酶液（ETOH）的配置：
50%ETOH(50ml) : 50% Ethanol25ml ; 20% HEPES 10ml; 30% dd h2o
80%ETOH(200ml): 80% Ethanol160ml ; 20% HEPES
将每个Eppendorf管中加入0.4ml 80%ETOH，涡旋后置于80℃下振荡处理15min.。经高速离心机离心3min.（1200rpm），收集上清液并放入冰冻盒内置于暗处保存。剩余物加入0.4ml 的50%ETOH重复进行提取，并将提取的上清液与第一次提前的上清液混合核心期刊目录。最后的剩余物加入0.2ml 的80%ETOH再次进行提取直至样品呈现清透状。将多次提取的上清液混合经0.45um滤膜过滤后进行HPLC分析。
1.2.3 酒精提取法
配置80%酒精待用。并将台式离心机（Centrifuge）、振荡摇床(Eppendorf Thermomixer）放入10℃冷室内预冷30min，以使机器温度与室温相同。每管中分别加入1ml的80%酒精农业论文，用涡旋机高速处理几分钟，使干物质与酒精充份混合。低温（8℃）下充分振荡30min.（1400rpm）。然后放入高速离心机处理离心10min.(14000rpm),此处理依然在低温下进行。取出小管静置后提取上清液。剩余样品用0.5ml80%酒精重复进行提取，将多次提取的上清液混合。
将盛上清液的Eppendorf管打开盖，放于通风橱内3-5天，让酒精挥发净（如不能及时进行下一步，应储存在冰箱冷藏室内）。用蒸馏水定容到ml,将干物质充分溶解，滤膜过滤后进行HPLC分析，所测可溶性糖为生物组织中普遍存在的果糖、葡萄糖与蔗糖。
2.结果与分析
2.1 芽内可溶性糖提取方法的比较
对绣球花芽体内果糖、葡萄糖和蔗糖的测定结果显示:3种提取方法在果糖（图1-1）与葡萄糖（图1-2）的测定结果中具有相近的散点曲线图，同处理样品的水解法（Water）的测定值与其他两种提取方法间存在较大差异。在果糖和葡萄糖的测定中，酒精提取法（Ethanol）与酶解法(Enzyme)的散点曲线较为接近，表明这两种方法对于果糖和葡萄糖的测定结果影响较一致。
蔗糖的测定结果（图1-3）中，水解法与酶解法具有相对一致的曲线，酶解法各处理间差异值明显高于水解和酒精萃取的处理结果。同一样品的3种处理结果中,水处理的蔗糖值始终表现最低。
酶解法在3种糖的测定结果中，表现相一致的波动曲线。
2.2 茎段内可溶性糖提取的方法比较
对绣球花茎段内可溶性糖的测定结果显示，对3种糖的提取结果均表现为：酒精提取法与酶解法的散点曲线近乎重合，与水解法的曲线明显不同，表明酒精法与酶解法对茎段组织内可溶性糖成分的测定具有一致的提取效果。
果糖（图2-1）、葡萄糖（图2-2）、蔗糖（图2-3）、的曲线中，3种提取方法在蔗糖的测定值中具有几乎一致的曲线波值，但水解法提取的结果明显高于酒精与酶解的提取方法，并且在其他两种糖分测定中也表现出同样的差异。
3、讨论
3.1 利用HPLC对绣球花的芽及茎段内葡萄糖和果糖的测定结果表明：酶解法与酒精提取法具有基本一致曲线，提取结果好于水解法。茎段组织内的葡萄糖和果糖测定值几乎一致，明显好于芽组织的测定结果，显示出相同植物的不同组织间，尽管采用相同的提取方法，但测定结果间会可能会存在差异。
3.2 由于葡萄糖、果糖、麦芽糖等分子中均含有游离的、具还原性的半缩醛烃基农业论文，被称为还原性可溶性糖[12]，由此可以推断利用酶及酒精进行的样品提取方法，最适宜对绣球花属植物还原性可溶性糖的测定。
蔗糖分子中则不具有游离的、具还原性的半缩醛烃基，因此被称为非还原性可溶性糖，并在蔗糖分解酶(A I、N I、SSC) 的作用下被分解成葡萄糖和果糖储藏于液泡中( Swanson & El2Shishiny, 1958) [13]。茎段组织内酶解法与酒精提取法的蔗糖提取值几乎一致，而芽组织中水解法与酶解法的测定结果相近，表明利用HPLC对绣球花属可溶性非还原糖的测定中，酶提取是最适宜的样品处理方法。
3.3 水解法中长时间的水份蒸发可能引起提取液浓度的改变，这或许是茎段组织处理中，水解法测定值普遍高于其他两种方法的原因。相对于酒精提取法，酶解法更简便易操作，所需样品处理时间短，可以最大程度降低人为因素对提取结果的干扰。因此，利用HPLC对绣球花属植物中可溶性糖进行测定，酶解提取法是最适宜的样品提取方法，其次为酒精提取法。
参考文献
[1]张继澍．植物生理学[M]．西安：世界图书出版公司，1999：370―376．
[2]Johs Bak Henriksena.Onthe Sugar Content of Wheat Plants and their Resistance to Cold[J], Acta AgriculturaeScandinavica, 1961,11: 3, 291 ― 296。
[3]王孝宣，李树德。番茄品种耐寒性与ABA和可溶性糖含量的关系[J]，园 艺 学 报 1998, 25 (1) : 56～60
[4]范月仙，李生泉.棉苗抗冷性与其可溶性糖含量变化关系的研究[J]，棉花学报，1995，7（2），126-127。
[5]齐红岩,李天来,张洁,刘海涛.番茄果实发育过程中糖的变化与相关酶活性的关系[J],园艺学报,2006, 33 (2) : 294～299
[6]宋瑾,范培格,吴本宏,李绍华.葡萄延迟采收期间糖含量及其代谢酶活性的变化[J],园艺学报,2007, 34 (4) : 823 - 828
[7]李章万，徐秀荣。色谱分析中生物样品的前处理方法[J]，药物分析杂志，16（1），1996。
[8]Xiaoqi Zhang,Paul L. Bishop,Brian K. Kinkle。Comparison of extraction methods for quantifying extracellularpolymers in biofilms [J]，Water Science and Technology，39, Issue 7, 1999,39(7):211-218
[9]晏桂敏、林燕飞、孙静芸、胡巧平。山茱萸中马钱苷含量测定的样品处理方法改进[J].中国药业,2005,14(10):38-39
[10]ShiraishiM. 1993. Three descrip tors for sugars toevaluate grape germp lasm. Euphytica, 71: 99 - 106.
[11]Dale Smith, G. M.Paulsen, and C. A. Raguse.Extraction of Total Available Carbohydrates from Grassand Legume Tissue PlantPhysiology Vol. 39, No. 6 (Nov., 1964), pp. 960-962.
[12]潘瑞炽。植物生理学，2001.06，高等教育出版社
[13]Swanson C A, El2Shishiny E D H. 1958. Translocation of sugars inthe Concord grape. Plant Physiology, 33: 33 - 37.
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