| 单、二、三核苷酸重复基元明显高于四、五、六核苷酸类型，前三者分别占SSR总数的10.90%、43.94%、44.00%，而后三者均不足1.00%。二核苷酸和三核苷酸重复的出现频率相近，数量最多。而数目越多的重复基元出现的平均距离越小。
表1草莓EST中SSR出现频率
Table1OccurrenceofSSRsinstrawberryESTs
|
重复类型
Repeat type classes
|
SSR数目
Number of SSRs
|
百分比
Percentage (%)
|
平均距离/kb
Mean distance
|
|
单核苷酸Mononucleotide
|
197
|
10.90
|
50.61
|
|
二核苷酸Dinucleotide
|
794
|
43.94
|
12.56
|
|
三核苷酸Trinucleotide
|
795
|
44.00
|
12.54
|
|
四核苷酸Tetranucleotide
|
16
|
0.89
|
623.08
|
|
五核苷酸Pentanucleotide
六核苷酸Hexanucleotide
合计Total
|
4
1
1807
|
0.22
0.05
100
|
2492.34
9969.35
5.52
|
表2不同重复基元类型的EST-SSR分布频率
Table2FrequencyofclassifiedrepeattypesinEST-SSR
|
重复类型
Repeat type classes
|
重复基元
Repeat motifs
|
数目
Numbers
|
百分比
Percentage (%)
|
|
单核苷酸
Mononucleotide
|
A/T
C/G
|
184
13
|
10.18
0.72
|
|
二核苷酸
Dinucleotide
|
AC/GT
AG/CT
AT/AT
CG/CG
|
41
691
61
1
|
2.27
38.24
3.38
0.06
|
|
三核苷酸
Trinucleotide
|
AAC/GTT
AAG/CTT
AAT/ATT
ACC/GGT
ACG/CTG
ACT/ATG
AGC/CGT
AGG/CCT
AGT/ATC
CCG/CGG
|
59
278
14
82
38
40
63
141
24
56
|
3.27
15.38
0.77
4.54
2.10
2.21
3.49
7.80
1.33
3.10
|
各种主要SSR类型如表2所示，各种不同重复基元出现频率存在很大差异，取百分比高于1%的核苷酸重复基元分析，结果表明A/T在单核苷酸中占了极大份额（10.18%），AG/CT在二核苷酸重复类型中出现频率最高（38.24%），而AAG/CTT是三核苷酸重复类型中的优势基元（15.38%）。二核苷酸重复基元有四种，除AG/CT外，AC/GT、AT/AT比例相关不大，远高于CG/CG。三核苷酸重复基元有十种，AGG/CCT、ACC/GGT、AGC/CGT、AAC/GTT、ACT/ATG、ACG/CTG出现频率分别为7.80%、4.54%、3.49%、3.27%、2.21%、2.20%，AGT/ATC、AAT/ATT出现频率较低。
对于基元重复长度，二核苷酸跨度最大，从12-130bp，三核苷酸跨度小于二核苷酸，从15-42bp；对于平均长度，五核苷酸最大为31.25bp,而三核苷酸最小为17.46bp（表3）。2.2草莓EST-SSR引物设计及其有效性
利用Primer5对235条系列进行SSR引物设计，共设计47对（代号JAAS1-47）引物。用这47对标记扩增生产上主栽的遗传差异较小的三个日本草莓品种红颊、明宝，佐贺清香，以检测引物的扩增成功率以及多态性。结果表明，44对引物能成功扩增，6对引物表现多态性（表3），引物的有效扩增率达93.62%，多态性占12.77%，说明利用草莓EST序列开发EST-SSR标记是可行的，并能有效的用于草莓品种的鉴定。
表3基元类型的重复长度分布
Table3Distributionofrepeattypeclassesbasedonsize
|
重复类型
Repeat type classes
|
跨度(bp)
Range
|
平均长度
Average size
|
|
二核苷酸Dinucleotide
|
12-130
|
19.87
|
|
三核苷酸Trinucleotide
|
15-42
|
17.46
|
|
四核苷酸Tetranucleotide
五核苷酸Pentanucleotide
六核苷酸Hexanucleotide
|
20-36
25-40
30
|
22.40
31.25
30
|
表4草莓6对多态性EST-SSR引物信息
Table46primerpairsfromstrawberry
|
引物
Primer
|
基元
Motif
|
Tm
℃
|
引物序列
Primer Sequences
|
扩增长度
bp
|
|
JAAS3
|
(AG)
|
62
|
F-CGAGGTCCCGATGTCGTTGT
R-TGATGCTGGCGTTGATGGTT
|
135
|
|
JAAS7
|
(CAC)
|
62
|
F-AGCAGCAACATTTCCAGACA
R- TCGGGCCTTAACTTCCTCTA
|
115
|
|
JAAS11
|
(CT)
|
59
|
F-TATTCAACCCTCTACCACCA
R-CAACAATCAAAGCTATAAGA
|
180
|
|
JAAS13
|
(AAG)
|
61
|
F-TGCCCTACTTTCACTTTCCT
R-CATACGCAGCGACATCTTCT
|
85
|
|
JAAS38
JAAS44
|
(CCA)
(TC)
|
61
60
|
F-AAGAGCTTTGCGTTTTCCTC
R-CACTATGTCGGCTTTGAACC
F-TTTTACAGACTGCTACAGAG
R-AGATGAAGAAGATGGAGAAG
|
230
280
|
M：分子量marker；1-3：日本草莓品种（1：明宝，2：佐贺清香，3：红颊）；引物：JAAS1-15
M:marker;1-3:Japanesestrawberrycultivar(1:Meiho,2:Sagahonoka,3:Benihoppe);primer:JAAS1-15
图1不同EST-SSR引物在不同日本品种中的扩增结果
Fig.1TheamplificationresultsofdifferentEST-SSRprimerindifferentJapanesecultivar
前人研究表明，不同物种占优势的EST-SSR重复类型有所差异。在葡萄、柑橘中以三核苷酸重复为主，而在猕猴桃、核桃、杏和桃等中则是二核苷酸重复最多。本研究中，草莓EST-SSR序列中，二核苷酸重复和三核苷酸重复出现频率最高，三核苷酸稍高二核苷酸，二核苷酸重复中以AG/CT占主导，这与蔷薇科植物分布相同，证实了Gupta的观点，但与Powell认为的植物中主要二核苷酸重复是AT/AT相异。AG/CT根据读码框不同可以代表不同密码子如UCU、CUC、GAG、AGA，它们被翻译成甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、谷氨酸，而甘氨酸、亮氨酸在草莓等蔷薇科植物中使用频率较高，因此AG/CT在二核苷酸重复中占绝对优势；本研究三核苷酸重复以AAG/TTC重复为主，是植物EST中三核苷酸重复的主要SSR类型。
对含有SSR位点的EST序列设计引物并分析其扩增效率、检验其多态性是标记开发的关键。已有研究表明成功扩增比例最高的是苹果100%，最低的是葡萄62.5%，本研究中设计引物的有效扩增率93.62%，介于两者之间。由于扩增的模板是基因组DNA，因此成功扩增不仅与EST序列质量、引物设计相关，而且与扩增区是否含有内含子显著相关。在标记的多态性比例上本研究为12.77%，导致EST多态性低的原因是由于EST序列的保守性[21]和多态性检验材料的遗传上高度相似性。EST不同区域的引物在不同属间、种间和品种间有不同水平的差异性，5’端和3’端非编码区的引物在品种间和种间多态性较多，尤其是3’端非编码区由于经常发生cDNA的剪切，在品种间的多态性较高，本研究所用EST多采用编码区；同时如果用来源更广、差异更大的材料用于检验，多态性可能会更多。 2/3 首页 上一页 1 2 3 下一页 尾页 |
