论文摘要：从公共数据库中下载61, 731条草莓表达序列标签（EST），组装后得到系列非冗余EST 14, 948条，总长度为9, 969.35 kb，挖掘到1, 807个SSR，分布在1, 515条序列上，发生频率为10.14%，平均每5.52 kb出现1个SSR。其中，235条系列包含2个或2个以上SSR，76个SSR以复合形式出现。二核苷酸(794个SSR)和三核苷酸(795个SSR)是主要的类型，所占比例分别为43.94%和44.00%。AG/CT（691个）和 AAG/CTT（278个）在二、三核苷酸中占主导地位。利用这些序列，设计47对引物，对生产上主栽的3个日本品种进行多态性研究，44对引物有扩增产物，6对表现多态性。结果表明，从草莓相关EST数据库中开发的EST-SSR引物可行且有用，在草莓品种鉴定、种质资源分析、遗传作图等研究方面有广阔的应用前景。
论文关键词：草莓,标记开发
简单序列重复简称SSR，是一类由几个（多为1-6个）碱基为单位串联重复的DNA序列，表达序列标签简称EST，是来源于一定环境（正常生长或逆境胁迫等）一定组织（根、茎、叶、花、果等）一定长度（20-700bp不等）的cDNA片段，EST-SSR标记是近年来新发展的来自于比较保守的转录区的SSR标记。与普通SSR标记相比，它是功能基因的序列，高质量标记的比率较多；开发过程简单成本低；是一种有功能的分子标记。
随着大规模基因组测序的发展，公共序列数据库中集中了大量可用的EST序列，从公共数据库获得EST序列开发EST-SSR标记是一种非常快速、高效的方法。这种方法已经被越来越多的果树研究者用来开发EST-SSR标记，并在遗传多样性、亲缘关系、功能基因定位、遗传作图中得到应用。目前，已发表的草莓属SSR标记数目约250个，这些标记来源于基因组文库，GenBank序列。草莓相对于其他果树甚至蔷薇科果树开发并发表的SSR标记数目较少，有必要开发大量的SSR标记，尤其是功能性EST-SSR标记，以丰富草莓SSR标记数目，为草莓基因组学研究及育种提供帮助。
本研究从公共数据库中下载草莓EST序列，去冗余处理后，用SSR搜索工具对这些序列进行搜索，对搜索到的包含SSR的EST序列用PrimerPremier5.0设计引物，并用3个主栽草莓品种检测新开发的SSR标记，确定引物的多态性和有用性，为今后开发EST-SSR标记提供参考。
1材料和方法
1.1草莓EST序列来源
草莓EST来自NCBI(美国国家生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、PlantGDB(http://www.plantgdb.org/)、和http://www.bioinfo.wsu.edu/cgi-bin/gdr/gdr_unigeneV4_project_description.cgi?genus=fragaria三个网站的EST，共计61,731条。
1.2EST-SSR挖掘
首先，用SeqClean（http://www.tigr.org/tdb/tgi/software）去除载体、线粒体叶绿体等序列及冗余，然后用EST-trimmer（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/est_trimmer.pl）除去5’端或3’端50bp的polyT或polyA，并剔除小于100bpESTs。前处理后的EST通过软件Phrap进行片段重叠群分析和聚类。拼接时设定的初始装配参数为:最小匹配碱基数(minmatch)为20,最小分值(minscore)为40。对错误拼接序列设置比较高的装配参数再次进行拼接、判别,共进行了3次。用SSRIT（http://gramene.agrinome.org/db/searches/ssrtool）检索SSR-EST。筛选标准为:单核苷酸重复的次数在16次或16次以上，二核苷酸重复的次数在6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上。同时，也筛选中间被少数碱基（间隔小于10或等于10）打断的不完全重复的SSR。
1.3EST-SSR引物设计
利用PrimerPremier5.0软件设计SSR位点两侧引物。参数设置如下：产物长度范围设为75-350bp，引物长度范围为18-27bp，最佳为20bp。其它参数采用默认值。引物设计时确保产物序列中包括SSR位点。选用软件给出的最优的设计结果合成引物，引物由上海invitrogen设计。
1.4DNA提取、PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
试验材料生产上主栽的日本品种：红颊、明宝，佐贺清香。DNA提取采用CTAB法（陆苏瑀等，2010）。PCR反应体系为25μL，其中包括：1×Buffer，1.5mmol·LMgCl200mmol·LdNTPs，0.3mmol·L引物，0.5UTaq酶，50ngDNA模板，所用试剂均购自Fermentas公司。PCR扩增反应条件是：94℃预变性4min；94℃30s，合适温度退火45s，72℃延伸1min，30-35个循环；72℃延伸5min。PCR产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在Bio-Rad序列分析电泳槽电泳，75W，1-1.5h。银染法染色（陆苏瑀等，2010)。
2结果与分析
2.1草莓EST-SSR出现的频率和特点
从NCBI等公共数据库下载61,731条草莓EST，检测的系列非冗余EST14,948条，总长度为9,969.35kb，挖掘到1,807个SSR，分布在1,515条序列上，发生频率（检出的SSR的EST数目与EST数目之比值）为10.14%，平均每5.52kb出现1个SSR。(表1)。从表1可知，草莓EST-SSR种类丰富，一至六核苷酸重复类型都能被检出，但各类型的SSR出现频率迥异。 1/3 1 2 3 下一页 尾页 |
