论文摘要：为了正确使用银杏种间资源，利用碱提法分别对雌雄银杏叶（各十份）总黄酮的进行比较；为了筛选雄性银杏叶最佳碱提法提取工艺，利用正交设计实验，考察了提取时间、PH、提取温度、液料比四个因素对雄性银杏叶总黄酮碱提法工艺的影响，并用分光光度法测定总黄酮的含量。
论文关键词：雌雄银杏叶,总黄酮,正交试验,提取工艺
银杏为雌雄异株，中国是银杏的原产地，在长期的演化过程中形成了丰富的雄株种质资源，因此进行银杏雄株和雌株叶片总黄酮含量分析,对合理利用银杏种间资源意义重大。银杏叶中黄酮类化合物的提取率直接决定银杏叶的药用价值，本文以银杏总黄酮的提取率为指标对银杏叶提取物的提取和精制工艺进行研究,比较雌雄银杏叶总黄酮含量，和银杏叶总黄酮提取体系优化。本文采用碱提法提取银杏叶总黄酮。实验结果表明：雄性银杏叶总黄酮含量总体上大于雌性银杏叶总黄酮的含量；雄性银杏叶总黄酮碱提法的最佳提取工艺条件为：提取时间2.5h,PH=11,提取温度70℃，液料比1:15。结论：碱提法提取叶总黄酮工艺简单稳定、成本较醇提法低，方法合理可行，可以运用大规模工业化生产。
1实验过程
1.1芦丁标准母液的制备
精确称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用60%乙醇溶解并定容至10ml容量瓶，摇匀，摇匀既得2mg/mL的芦丁标准母液。
1.2芦丁标准曲线的制备
精密吸取对照溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL分别置于编号1、2、3、4、5、6、7号的10mL具塞刻度试管中,先加5%亚硝酸钠溶液0.3mL,摇匀,放置6min,再加10%硝酸铝溶液0.3mL,摇匀,再放置5min,加4%氢氧化钠溶液4mL,各加60%乙醇定容至10mL,放置15min,在波长510nm处测定各试管中溶液的吸光度。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得回归方程:y=1.7615x+0.0103,R=0.9985.线性关系良好。
1.1.3雌雄银杏叶总黄酮的提取
分别称取雌雄银杏叶十份，每份1g，分别编号1-10.用PH=10的NaOH浸出，液料比为1:20，在50℃的条件下提取2小时。浸出液经离心后，用30%乙醇定容至10mL。
1.1.4雄性银杏叶总黄酮的优化体系筛选
对雄性银杏叶总黄酮的优化体系筛选采用4因素3水平的正交设计实验，对提取时间、提取温度、PH、液料比进行了筛选。正交试验设计详见表1。
表1正交试验设计
|
处理
|
提取时间
|
PH
|
温度
|
液料比
|
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
|
2
|
1
|
2
|
2
|
2
|
|
3
|
1
|
3
|
3
|
3
|
|
4
|
2
|
1
|
2
|
3
|
|
5
|
2
|
2
|
3
|
1
|
|
6
|
2
|
3
|
1
|
2
|
|
7
|
3
|
1
|
2
|
3
|
|
8
|
3
|
2
|
3
|
1
|
|
9
|
3
|
3
|
1
|
2
|
1.1.5雌雄银杏叶总黄酮的测量
按上述操作方法对雌雄银杏叶总黄酮提取液在分光光度计下测定。
提取率=(c×d×v)/m×100%.
式中:c为样品的黄酮浓度mg/mL；v为样品溶液的体积/mL；d为样品的总稀释倍数,m为样品的质量/mg。总黄酮含量(%)=供试品吸光度×标准品相当芦丁量/标准品吸光度×供试品量
2实验结果及分析
2.1雌雄银杏叶总黄酮比较
在同一碱提取条件下，分别对雌雄银杏叶总黄酮提取液（各十份）含量（参照芦丁标准曲线）进行了比较，结果详见表2.
表2雌雄银杏叶总黄酮含量比较
|
编号
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
|
雄性
|
吸光度
|
0.198
|
0.197
|
0.194
|
0.196
|
0.194
|
0.196
|
0.195
|
0.193
|
0.197
|
0.195
|
|
浓度（mg/mL）
|
0.338
|
0.336
|
0.331
|
0.335
|
0.331
|
0.335
|
0.333
|
0.330
|
0.336
|
0.333
|
|
含量（%）
|
3.38
|
3.36
|
3.31
|
3.35
|
3.31
|
3.35
|
3.33
|
3.30
|
3.36
|
3.33
|
|
雌性
|
吸光度
|
0.192
|
0.189
|
0.190
|
0.188
|
0.190
|
0.187
|
0.188
|
0.187
|
0.191
|
0.189
|
|
浓度（mg/mL）
|
0.328
|
0.323
|
0.324
|
0.321
|
0.324
|
0.319
|
0.321
|
0.319
|
0.326
|
0.323
|
|
含量（%）
|
3.28
|
3.23
|
3.24
|
3.21
|
3.24
|
3.19
|
3.21
|
3.19
|
3.26
|
3.23
|
通过表2可以看出，雄性银杏叶总黄酮的最小含量3.30mg/mL比雌性银杏叶总黄酮的最大含量3.28mg/mL大，所以，雄性银杏叶的总黄酮含量总体上大于雌性银杏叶总黄酮含量。
2.2雄性银杏叶总黄酮优化体系筛选
按照正交试验方案对总黄酮提取条件进行了研究，结果见表3。
表3雄性银杏叶总黄酮反应体系正交优化
|
处理
|
提取时间（h）
|
PH
|
温度(℃)
|
液料比
|
吸光度
|
浓度（mg/mL）
|
产率（%）
|
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
0.179
|
0.305
|
3.05
|
|
2
|
1
|
2
|
2
|
2
|
0.175
|
0.298
|
2.98
|
|
3
|
1
|
3
|
3
|
3
|
0.168
|
0.286
|
2.86
|
|
4
|
2
|
1
|
2
|
3
|
0.172
|
0.293
|
2.93
|
|
5
|
2
|
2
|
3
|
1
|
0.201
|
0.344
|
3.44
|
|
6
|
2
|
3
|
1
|
2
|
0.189
|
0.323
|
3.23
|
|
7
|
3
|
1
|
2
|
3
|
0.187
|
0.319
|
3.19
|
|
8
|
3
|
2
|
3
|
1
|
0.209
|
0.358
|
3.58
|
|
9
|
3
|
3
|
1
|
2
|
0.199
|
0.340
|
3.40
|
|
K1
|
8.89
|
9.17
|
9.68
|
10.07
|
|
|
|
|
K2
|
9.66
|
10.0
|
9.10
|
9.61
|
|
|
|
|
K3
|
10.17
|
9.49
|
9.88
|
9.19
|
|
|
|
|
R
|
1.28
|
0.83
|
0.78
|
0.88
|
|
|
|
|
最佳反应体系
|
提取时间2.5h,PH=11,提取温度70℃，液料比1:15
|
K1、K2、K3表示各个因素分别取3个水平时相应的试验结果之和；（本表以产率为对照），R是K1、K2、K3中最大值与最小值之差，它反映了试验中各因素影响的大小。它们的大小顺序反映出相关因素分别取三个水平时提取率的高低。由表3可看出，各因素对银杏叶总黄酮提取的影响大小顺序为：提取时间>液料比>PH>提取温度。
2.3正交试验验证
根据正交试验结果最终确定的提取方案进行重复8次试验，每次称取银杏叶1.0g提取时间2.5h，PH=11，提取温度70℃，液料比1:15，按上述测定法测定总黄酮含量。
表4最佳反应体系检验
|
检验
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
平均
|
|
浓度mg/ml
|
0.347
|
0.339
|
0.354
|
0.336
|
0.350
|
0.352
|
0.349
|
0.339
|
0.345
|
上表表明碱提法工艺提取的银杏叶总黄酮含量较高并且稳定，该工艺稳定可行。
3结论
本实验研究对银杏叶总黄酮的成本低，且提取率叶较高，适合于大规模生产。雄性银杏叶总黄酮的最佳反应体系为提取时间2.5h，PH=11，提取温度70℃，液料比1:15。并且得出雄性银杏叶总黄酮的含量总体上大于雌性银杏叶总黄酮的含量。在实际对银杏资源的利用上可以适当加大对雄性银杏的利用。
参考文献
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