论文摘要：对浙江某养殖场患“腐皮病”的中华鳖进行了病原菌分离，分离到2株细菌（编号为040908-1和040908-2）。经人工感染试验证明，这2株细菌都是引起该病的病原菌。分别采取传统细菌生理生化鉴定方法以及全自动细菌鉴定仪VITEK-32对这2株细菌进行了鉴定，结果均表明菌株040908-1为普通变形菌（Proteus vulgaris），而菌株040908-2为维罗纳气单胞菌温和生物变种[U1] (Aeromonas veronii biovar sobria)。研究了27种药物对这2株细菌的药敏试验，结果显示，妥布霉素、新霉素、奥复欣、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素等6种药物对这2株细菌均有良好的抑制作用，氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素等4种药物仅能有效抑制菌株040908-1的生长，而复方新诺明仅对菌株040908-2有显著的抑制作用。
论文关键词：中华鳖,腐皮病,普通变形菌,维罗纳气单胞菌温和生物变种
中华鳖是浙江省四大水产养殖主导品种之一，据统计，2008年全省养殖鳖产量达到103960吨。随着浙江省中华鳖养殖的快速发展和集约化程度的不断提高，中华鳖发病日趋增多，给养殖业带来巨大的经济损失。“腐皮病”是中华鳖养殖过程中的主要病害之一，[U3]发病范围广，持续时间长，对浙江省中华鳖养殖产业造成了严重的损失。本文对我省中华鳖“腐皮病”的病原进行了初步分离研究。
1材料与方法
1.1材料
病鳖取自浙江德清某养殖场，活力差，四肢、颈部、背甲及裙边均有皮肤溃烂病灶；健康鳖取自浙江萧山某养殖场。
1.2病原菌分离
取症状典型的病鳖，无菌条件下从病鳖肝、肾、脾等组织取样，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28C恒温培养24h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行克隆培养，共分离到040908-1、040908-2两株细菌，转接斜面保存备用。
1.3人工感染试验
试验采用60cm×50cm×40cm的塑料箱，每箱放养体重50g~80g的健康中华鳖5只，[U4]水温保持25℃左右，连续充气，暂养一天后进行感染试验。试验菌株培养18h~24h后，以无菌生理盐水制成菌悬液，菌悬液含菌量按McF浊度管结合活菌计数方法确定，菌株040908-1为7.5×10cfu/ml，菌株040908-2为1.2×10cfu/ml。以从右后肢注射（0.2ml/只）的方法，将2株菌分别单独或者混合进行人工感染试验。对照组注射等量无菌生理盐水。感染组与对照组均设立两个平行组。
1.4病原菌鉴定
按照常见细菌系统鉴定手册、伯杰细菌鉴定手册（第九版）的方法进行细菌学鉴定。同时采用VITEK32全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司，bioMérieux）的GNI卡进行比较鉴定。
1.5药敏试验
在普通营养琼脂培养基上以纸片法测定病原菌对不同药物的敏感性，经28℃恒温培养24h，观察抑菌圈的有无并用游标卡尺测量其直径，抑菌圈越大，则病原菌对该种药物越敏感。药敏纸片（直径6mm）购自杭州微生物试剂有限公司。同时采用VITEK32全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司，bioMérieux）的药敏试验卡（GNS506）进行MIC测定。
2结果
2.1人工感染试验结果
人工感染试验结果见表1。健康鳖经040908-1、040908-2两菌株人工感染，2d后陆续发病，发病率为100％；4d后病势加重并出现死亡，7d内全部死亡。人工感染的病鳖与自然发病鳖的症状基本一致。从感染死亡鳖分离细菌作鉴定，结果与试验菌株完全相同。试验期间对照组鳖健康活泼，无任何症状。由此证明菌株040908-1、040908-2均为中华鳖“腐皮病”的致病菌。
表1人工感染试验结果
Tab.1Resultsofartificialinfectiontest
|
菌株
|
菌液浓度
（CFU/ml）
|
注射量
（ml/只）
|
试验数
（只）
|
累计死亡数
（只）
|
死亡率
（％）
|
|
040908-1
|
7.5×10
|
0.2
|
5
|
5
|
100
|
|
040908-2
|
1.2×10
|
0.2
|
5
|
5
|
100
|
|
040908-1/040908-2
|
7.5×10 /1.2×10
|
0.1+0.1
|
5
|
5
|
100
|
|
对照
|
无菌生理盐水
|
0.2
|
5
|
0
|
0
|
2.2病原菌鉴定结果
两株病原菌鉴定结果如表2所示。菌株040908-1杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，具有运动性，氧化酶阴性，触酶阴性，生理生化反应与文献所述普通变形菌基本一致。菌株040908-2杆状，革兰氏阴性，氧化酶阳性，生理生化反应与文献所述维罗纳气单胞菌基本一致。
根据全自动细菌鉴定仪VITEK-32的鉴定结果（表3），菌株040908-1的生物编码为6012140120，属于普通变形菌（概率为99％）。菌株040908-2的生物编码为7000300064，属于维罗纳气单胞菌温和生物变种（概率为90％）。
表2分离菌株的生理生化特性
Tab.2Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsoftheisolatedbacteria
|
鉴定项目
|
040908-1
|
040908-2
|
鉴定项目
|
040908-1
|
040908-2
|
|
菌体形状
|
杆状
|
杆状
|
柠檬酸盐利用
|
－
|
-
|
|
革兰氏染色
|
-
|
-
|
液化明胶
|
+
|
/
|
|
葡萄糖氧化发酵
|
F
|
F
|
水解淀粉
|
/
|
+
|
|
葡萄糖产气
|
+
|
+
|
葡萄糖产酸
|
+
|
+
|
|
氧化酶
|
-
|
+
|
肌醇
|
－
|
-
|
|
接触酶
|
+
|
/
|
山梨醇
|
－
|
-
|
|
吲哚
|
+
|
+
|
蔗糖
|
+
|
-
|
|
甲基红
|
-
|
-
|
乳糖
|
－
|
-
|
|
V.P.
|
+
|
+
|
果糖
|
+
|
/
|
|
产硫化氢
|
+
|
-
|
甘露糖
|
-
|
-
|
|
七叶苷
|
+
|
-
|
纤维二糖
|
+
|
/
|
|
水杨苷
|
－
|
-
|
阿拉伯糖
|
－
|
-
|
|
丙二酸盐
|
－
|
-
|
麦芽糖
|
+
|
+
|
|
赖氨酸脱羧酶
|
-
|
+
|
半乳糖
|
+
|
/
|
|
精氨酸双水解酶
|
-
|
+
|
鼠李糖
|
－
|
-
|
|
鸟氨酸脱羧酶
|
-
|
+
|
甘露醇
|
-
|
-
|
|
脲酶
|
+
|
-
|
密二糖
|
－
|
/
|
|
β-半乳糖甙酶
|
-
|
-
|
苦杏仁甙
|
-
|
/
|
|
硝酸盐还原
|
+
|
+
|
木糖
|
/
|
-
|
|
动力
|
+
|
+
|
KCN
|
-
|
-
|
|
棉子糖
|
-
|
-
|
甘油
|
/
|
+
|
表3分离菌株的VITEK-32鉴定结果
Table3ResultidentifiedbyVITEK-32oftheisolatedbacteria
|
项目
|
结果
|
项目
|
结果
|
|
040908-1
|
040908-2
|
040908-1
|
040908-2
|
|
三氯新DP3
|
-
|
+
|
葡萄糖氧化OFG
|
+
|
+
|
|
阳性生长控制GC
|
+
|
+
|
乙酰氨ACE
|
-
|
-
|
|
七叶灵ESC
|
-
|
-
|
植物尿母蓝PLI
|
-
|
-
|
|
尿素URE
|
+
|
-
|
枸橼酸盐CIT
|
-
|
-
|
|
丙二酸盐MAL
|
-
|
-
|
苯丙氨酸TDA
|
-
|
-
|
|
多粘菌素B PXB
|
+
|
-
|
乳糖LAC
|
-
|
-
|
|
麦芽糖MLT
|
+
|
+
|
甘露醇MAN
|
-
|
+
|
|
木糖XYL
|
-
|
-
|
棉子糖RAF
|
-
|
-
|
|
山梨醇SOR
|
-
|
-
|
蔗糖SUC
|
+
|
-
|
|
肌醇INO
|
-
|
-
|
侧金盏花醇ADO
|
-
|
-
|
|
香豆酸COU
|
-
|
-
|
硫化氢H2S
|
+
|
-
|
|
β-半乳糖苷酶 ONP
|
-
|
-
|
鼠李糖RHA
|
-
|
-
|
|
阿拉伯糖ARA
|
-
|
-
|
葡萄糖发酵GLU
|
+
|
+
|
|
精氨酸ARG
|
-
|
+
|
赖氨酸LYS
|
-
|
-
|
|
鸟氨酸ORN
|
-
|
-
|
氧化酶OXI
|
-
|
+
|
综合上述结果，可以把菌株040908-1和040908-2分别鉴定为普通变形菌Proteusvulgaris和维罗纳气单胞菌温和生物变种Aeromonasveroniibiovarsobria。
2.3药敏试验结果
用纸片法测定了2株细菌对27种药物的敏感性（表4）。妥布霉素、新霉素、奥复星、庆大霉素、卡那霉素等药物对2株细菌均有较强的抑制作用，氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素对菌株040908-1有显著抑制作用但对040908-2无抑制作用或仅有微弱抑制作用，而复方新诺明仅对040908-2有抑制作用。
表4药敏试验结果
Tab.4Sensitivitiesofstrain040908-1and040908-2to27antimicrobialagents
|
药物
|
含量
(μg /片)
|
抑菌圈（mm）
|
药物
|
含量
(μg /片)
|
抑菌圈（mm）
|
|
040908-1
|
040908-2
|
040908-1
|
040908-2
|
|
氯洁霉素
|
2
|
0
|
0
|
吡哌酸
|
30
|
19.92
|
0
|
|
复方新诺明
|
1.25/23.75
|
0
|
24.45
|
新霉素
|
30
|
21.28
|
21.55
|
|
氟哌酸
|
10
|
36.10
|
15.88
|
奥复星
|
5
|
28.74
|
22.20
|
|
磺胺异噁唑
|
300
|
0
|
0
|
链霉素
|
10
|
22.45
|
7.87
|
|
多粘菌素B
|
300 IU
|
0
|
9.41
|
新生霉素
|
30
|
10.40
|
9.73
|
|
氨苄青霉素
|
10
|
0
|
0
|
先锋必素
|
75
|
18.19
|
28.19
|
|
阿莫西林
|
10
|
0
|
0
|
万古霉素
|
30
|
0
|
0
|
|
青霉素
|
10 IU
|
0
|
0
|
庆大霉素
|
10
|
22.48
|
19.51
|
|
利福平
|
5
|
10.56
|
11.51
|
卡那霉素
|
30
|
29.56
|
19.47
|
|
羧苄青霉素
|
100
|
13.01
|
0
|
头孢羟唑
|
30
|
0
|
9.09
|
|
氧哌嗪青霉素
|
100
|
16.52
|
21.60
|
麦迪霉素
|
30
|
0
|
11.80
|
|
先锋霉素V
|
30
|
0
|
9.45
|
四环素
|
30
|
20.38
|
9.89
|
|
妥布霉素
|
10
|
24.99
|
21.54
|
强力霉素
|
30
|
18.97
|
16.99
|
|
丁胺卡那霉素
|
30
|
21.79
|
17.31
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
|
|
|
|
|
表5VITEKGNS-506卡测定结果
Table5SensitivitiesdetectedbyGNS-506
|
药物
|
040908-1
|
040908-2
|
|
MIC值（μg/mL）
|
是否敏感
|
MIC值（μg/mL）
|
是否敏感
|
|
Amoxicillin/CA阿莫西林/榛酸
|
≥32
|
R
|
≥32
|
R
|
|
Ampicillin氨苄西林
|
≥32
|
R
|
≥32
|
R
|
|
Cefotaxime头孢胺噻肟
|
≤4
|
S
|
≤4
|
S
|
|
Cefoxitin头孢西丁
|
4
|
S
|
≤2
|
S
|
|
Cefotazidime头孢他啶
|
≤8
|
S
|
≤8
|
S
|
|
Cephalothin头孢噻吩
|
≥32
|
R
|
16
|
I
|
|
Gentamicin庆大霉素
|
≤0.5
|
S
|
1
|
S
|
|
Imipenem亚胺培南
|
≤4
|
S
|
≤4
|
S
|
|
Nalidixic Acid喹啶酸
|
≤16
|
S
|
ND
|
ND
|
|
Netilmicin奈替米星
|
≤4
|
S
|
≤4
|
S
|
|
Nitrofurantoin呋喃妥因
|
≤32
|
S
|
≤32
|
S
|
|
Pefloxacin氟哌喹酸
|
≤1
|
S
|
≥4
|
R
|
|
Ticaracillin替卡西林
|
≤16
|
S
|
≤16
|
S
|
|
Tobramycin妥布霉素
|
1
|
S
|
2
|
S
|
|
Trimethsulfa复方新诺明
|
≥320
|
R
|
≤10
|
S
|
注：S——敏感；I——中间；R——耐药。 1/2 1 2 下一页 尾页 |
